高危型HPV mRNA表達(dá)陽(yáng)性率對(duì)不同程度宮頸病變的診斷價(jià)值

鄭海娜

東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)(南京市大廠醫(yī)院)(南京，210000)

宮頸癌是女性惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)每年的宮頸癌新增病例數(shù)高達(dá)50萬(wàn)，其中我國(guó)占到27.0%，已成為威脅女性健康與生命安全的重大疾病[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)為宮頸癌前病變，從CIN到宮頸癌是一個(gè)連續(xù)的發(fā)展過程，早期進(jìn)行宮頸癌篩查，發(fā)現(xiàn)癌前病變并采取有效的治療干預(yù)措施，對(duì)于降低宮頸癌的發(fā)病率具有重大意義[2]。宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查是臨床宮頸癌篩查常用手段，但易受主觀因素影響，尤其是對(duì)低度病變的篩查，敏感性和特異性均較低[3]。人乳頭瘤病毒(HPV)與宮頸癌的發(fā)生有著密切聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)HPV感染尤其是高危型HPV感染是宮頸癌及癌前病變發(fā)生的主要原因。為了解高危型HPV感染在宮頸病變?cè)\斷中的應(yīng)用價(jià)值，本研究對(duì)宮頸病變患者進(jìn)行了HPV DNA分型檢測(cè)及高危型HPV mRNA檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院婦科2015年7月—2017年7月接診的宮頸疾病患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：因接觸性出血或異常陰道出血、下腹隱痛、外陰瘙癢、白帶異常就診；有性生活史；無(wú)自身免疫性疾病；未服用過免疫抑制劑；無(wú)子宮手術(shù)史或放化療史；無(wú)急性生殖道炎癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：處于哺乳期或妊娠期者；近期應(yīng)用過免疫抑制劑者；合并自身免疫性疾病者；急性生殖道炎癥者；有宮腔手術(shù)史或放化療史者。入組患者均行宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)，根據(jù)TCT檢查結(jié)果、病史、盆腔體檢結(jié)果、陰道鏡活檢結(jié)果均診斷為宮頸疾病。共納入70例，年齡(37.2±10.3)歲(25～70歲)。包括慢性宮頸炎18例、CIN 41例(CINⅠ11例、CINⅡ10例、CINⅢ 20例)、宮頸癌11例。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1試劑與儀器PCR擴(kuò)增儀、醫(yī)用核酸分子快速雜交儀、恒溫水浴箱、離心機(jī)、冷光儀； HPV DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、HPV DNA雜交試劑盒(凱普生物化學(xué)有限公司)，宮頸穩(wěn)態(tài)檢測(cè)試劑盒(科蒂亞生物技術(shù)公司)。

1.2.2取材對(duì)患者采集TCT標(biāo)本(無(wú)菌棉拭子)，再采集HPV DNA和mRNA標(biāo)本(專用采樣器)。

1.2.3 HPV DNA檢測(cè)震蕩標(biāo)本保存液混合均勻細(xì)胞與保存液。取500μl上層清液離心(1min，1400r/min)去上清液。將400μl溶液Ⅰ(預(yù)熱至45℃)與標(biāo)本混合，冷卻后加入400μl 溶液Ⅱ，震蕩均勻，靜置2min，離心5min后去除上清液。靜置2min后加入60μl 溶液Ⅲ。取1μl待檢測(cè)樣本加入PCR Mix、DNA Taq酶、超純水行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。雜交液、雜交儀預(yù)熱至45℃，在金屬多孔板上放入標(biāo)記有21種常見HPV寡核苷酸探針的基因芯片雜交膜，一次性放入15個(gè)樣本行快速導(dǎo)流雜交。顯色后1h結(jié)果判讀：若為清晰可見的藍(lán)紫色圓點(diǎn)，則判定為陽(yáng)性，并根據(jù)雜交膜HPV亞型分布圖鑒定出HPV亞型；若有≥2個(gè)圓點(diǎn)表明為多重感染。HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68為高危型HPV亞型，HPV 6、11、42、43、44為低危型HPV亞型。

1.2.4高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)將標(biāo)本離心處理(5min，3000r/min)后棄上清液，加入雙蒸水形成混懸液，離心后去除上清液。在標(biāo)本中加入裂解液與雙蒸水，混合均勻后加入蛋白酶K，孵育1h(65℃)細(xì)胞裂解，中途可震蕩2次以加快裂解，去上清液待檢。取雙蒸水、裂解液、監(jiān)測(cè)探針、封閉反應(yīng)液按照不同的比例分別制成空白及陽(yáng)性質(zhì)控緩沖液、標(biāo)本緩沖液。在含特殊捕獲探針的96孔雜交板中依次加入標(biāo)本裂解液、標(biāo)本檢測(cè)緩沖液、空白及陽(yáng)性質(zhì)控緩沖液、雙蒸水、陽(yáng)性質(zhì)控緩沖液。封板，孵育3.5h(55℃)，讓HPV mRNA能夠與監(jiān)測(cè)探針充分接觸，發(fā)生雜交反應(yīng)。配置好預(yù)信號(hào)放大液、信號(hào)放大液、標(biāo)記探針混合液。去除雜交板，去除反應(yīng)液，使用洗脫液洗脫3次，加入預(yù)信號(hào)放大液，封板后孵育40min，取出后去除預(yù)信號(hào)放大液，洗脫3次，再加入信號(hào)放大液，封板孵育40min，取出雜交板后去除信號(hào)放大液，洗脫3次，再加入標(biāo)記探針混合液，封板孵育40min。取出雜交板后，去除標(biāo)記探針混合液，洗脫3次，加入底物催化劑與底物(3:1000)的混合液，封板孵育20min進(jìn)行底物發(fā)光反應(yīng)。取出雜交板，使用冷光儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)陽(yáng)性率比較

70例宮頸病變患者中，HPV DNA與高危型HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性檢出率未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。高危型HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ患者高于慢性宮頸炎患者(P<0.05)，CINⅡ、Ⅲ患者與宮頸癌患者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在慢性宮頸炎和CINⅠ患者中，HPV DNA陽(yáng)性率高于高危型HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率(P<0.05)。在CIN Ⅱ、Ⅲ患者中，高危型HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率與HPV DNA陽(yáng)性率未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 不同宮頸病變患者HPV DNA與HPV mRNA陽(yáng)性檢出比較

2.2 兩種檢測(cè)一致性分析

HPV DNA與HPV mRNA檢測(cè)的一致性隨宮頸病變程度的加重而升高，在慢性宮頸炎中，HPV DNA與HPV mRNA檢測(cè)的一致性尚可，在CIN和宮頸癌中兩種檢驗(yàn)擁有高度的一致性。見表2。

表2 HPV DNA與HPV mRNA檢測(cè)一致性分析(例)

2.3 不同檢測(cè)對(duì)高級(jí)別宮頸病變?cè)\斷

HPV mRNA對(duì)高級(jí)別宮頸病變(CIN及宮頸癌)的診斷敏感性、特異性及陰性預(yù)測(cè)值均高于HPV DNA(P<0.05)。見表3。

表3 不同檢測(cè)對(duì)高級(jí)別宮頸病變的診斷效率比較[%(例)]

3 討論

HPV是一種小分子量的、無(wú)包膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒， E2、E5、E6、E7已證實(shí)為病毒癌基因[5]。臨床已發(fā)現(xiàn)的HPV亞型超過了120種，而與生殖道病變相關(guān)的HPV亞型約有40多種，誘發(fā)宮頸癌變的HPV亞型則有20種。按照HPV各亞型致病能力的強(qiáng)弱可分為高危型HPV和低危型HPV兩類，低危型HPV主要引起皮膚黏膜良性增生及低級(jí)別CIN，而高危型HPV則可導(dǎo)致高級(jí)別CIN及宮頸癌的發(fā)生。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，在部分宮頸腺癌及所有宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，均可檢出HPV DNA。宿主細(xì)胞在受到HPV感染后，HPV通常會(huì)以整合或游離狀態(tài)存在，宮頸良性病變中的HPV DNA多為游離狀態(tài)，而宮頸癌細(xì)胞中的HPV則以整合狀態(tài)居多。HPV感染初期，病毒的癌基因表達(dá)水平較低，但隨著病毒基因組與宿主基因組的不斷整合，E6/E7 mRNA則會(huì)持續(xù)地進(jìn)行高水平轉(zhuǎn)錄，E6、E7癌蛋白表達(dá)水平不斷升高，從而促使宮頸癌變。宮頸癌與HPV尤其是高危型HPV感染有著密切聯(lián)系，從HPV感染到發(fā)展為宮頸癌的這一過程中，HPV癌基因的過度表達(dá)發(fā)揮著決定性作用，而E6、E7癌蛋白的持續(xù)表達(dá)又是宮頸組織惡變的關(guān)鍵性因素[7]。目前，在宮頸癌的篩查中，仍以HPV DNA檢測(cè)應(yīng)用最為廣泛，但研究發(fā)現(xiàn)[8]有90%的HPV感染可在感染后24個(gè)月內(nèi)自行清除，僅有持續(xù)性的高危型HPV感染才會(huì)導(dǎo)致癌變。所以HPV DNA檢測(cè)結(jié)果多反映暫時(shí)性HPV感染，而這些感染對(duì)宮頸癌病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)卻無(wú)實(shí)際意義。臨床必須定期反復(fù)進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)，結(jié)果顯示均為同一HPV亞型感染，才能認(rèn)為發(fā)生了HPV持續(xù)感染，這會(huì)給患者造成極大的心理負(fù)擔(dān)。

近年來(lái)，隨著臨床對(duì)E6、E7癌蛋白致癌機(jī)制的不斷明晰，有學(xué)者提出了通過檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA來(lái)預(yù)測(cè)宮頸癌病情進(jìn)展[9]。本次研究結(jié)果顯示，宮頸病變患者的HPV DNA與高危型HPV E6/E7 mRNA兩者陽(yáng)性檢出率并未見差異，但是在慢性宮頸炎和CINⅠ患者中，HPV DNA陽(yáng)性率高于高危型HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率。在患者中，HPV DNA與HPV mRNA檢測(cè)的一致性隨著宮頸病變程度的加重而升高。這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10]相符，HPV DNA對(duì)宮頸炎及低級(jí)別宮頸病變的檢出率較高，說(shuō)明HPV DNA檢測(cè)更傾向于將低風(fēng)險(xiǎn)、無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的宮頸病變歸入有較高惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)病變中去，從而增加過度檢查、過度治療風(fēng)險(xiǎn)。在慢性宮頸炎和CINⅠ患者中，高危型HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率較低，說(shuō)明高危型HPV在這部分患者中主要為游離狀態(tài)，癌基因表達(dá)水平較低，轉(zhuǎn)錄活性較弱，病毒的自然清除率較高，為臨床較好地避免過度檢查與過度治療提供參考。本次研究結(jié)果還顯示，HPV mRNA對(duì)高級(jí)別宮頸病變的診斷敏感性、特異性及陰性預(yù)測(cè)值均顯著高于HPV DNA，提示HPV mRNA檢測(cè)可更好地識(shí)別可能消退的HPV感染，同時(shí)早期發(fā)現(xiàn)有風(fēng)險(xiǎn)的HPV持續(xù)感染。

綜上所述，高危型HPV mRNA檢測(cè)對(duì)高級(jí)別宮頸病變有較高的診斷敏感性及特異性，其對(duì)高、低級(jí)別宮頸病變有較高的鑒別準(zhǔn)確性，其可作為臨床篩查宮頸病變的有效方法。