基于缺氧誘導因子及PI3K-AKT-mTOR信號通路誘導佐劑關節炎滑膜血管新生的實驗觀察

張曉軍，劉健，萬磊，黃傳兵，黃旦，齊亞軍

(1.安徽中醫藥大學，合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院)

類風濕關節炎(RA)炎癥會造成關節變形、甚至殘廢，嚴重影響患者生存質量。RA病理本質為血管炎和滑膜炎[1]。滑膜炎和血管炎的形成過程受多種因素調節，其中滑膜血管新生的形成與RA病理表現密切相關。研究發現新生血管生成不僅是維持滑膜細胞增生的必要條件，而且與滑膜炎癥程度有關[2]。RA滑膜血管新生機制復雜，近年來，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路和缺氧誘導因子1-α(HIF-1α)表達失衡成為研究的熱點[3]。HIF-1α是缺氧狀態下滑膜血管生成的核心調控因子，HIF-1α可以通過合成一氧化氮使血管舒張，上調血管內皮生長因子(VEGF-Α)表達使滑膜血管通透性增加。而VEGF-Α可以通過血小板衍生生長因子等一系列作用，誘導血管內皮細胞遷移和增生，產生細胞外基質，進而形成加重滑膜血管新生形成[4]。哺乳動物雷帕霉素靶向蛋白(mTOR)是HIF-1α的正性調節因子。PI3K-AKT-mTOR信號通路可以導致HIF-1a含量增加，進而促進滑膜血管新生形成。筆者通過弗氏完全佐劑(FCA)復制佐劑關節炎(AA) 大鼠模型，通過觀察AA大鼠滑膜血管新生表現，檢測滑膜血管PI3K-AKT-mTOR通路及HIF-1α表達，并分析PI3K-AKT-mTOR信號通路、HIF-1α與滑膜血管新生的關系，探討RA滑膜血管新生的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 大鼠：SD大鼠，由安徽省實驗動物中心提供。實驗動物經安徽中醫學院第一附屬醫院和基礎研究倫理委員會批準審核通過，清潔級標準飼養。

1.2 試劑 FCA：Sigma，USA,批號：116K8706；HIF-1α:Bioworld公司，USA,批號：22061046-1；VEGF-A試劑盒：美國santa cruz生物技術公司，批號：sc-507；VEGF-A試劑盒：圣塔克魯茲公司，USA，批號：sc-1045；MVD試劑盒：圣塔克魯茲公司，USA，批號：sc-376975；白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)試劑盒： RD公司，USA,批號：2013012205、2012100204。羊抗PI3K、鼠抗AKT1、兔抗p- AKT1、兔抗mTOR抗體：圣塔克魯茲公司，USA，批號： sc-48637、sc-5298、sc-135650、sc-8319；兔抗內皮抑素(ES):abcam公司，USA,批號：ab01387。

1.3 儀器與設備 病理切片機： LEICA，德國,型號：2235；顯微攝像系統：OLYMPUS,日本，型號:BX51T-32000-2；高速冷凍離心機：Sigma，德國，型號：2-16PK。電泳儀：美國Amersham公司,型號：EPS-301；凝膠圖像分析儀：美國Bio-RAD公司，型號：Gel Doc XR。

1.4 方法

1.4.1 模型制備與分組 采用隨機數字表法將30只將大鼠均分為正常組和模型組。向模型組大鼠注射FCA 0.1mL致炎,復制成 AA大鼠模型[5]，致炎后第19天開始檢測指標。

1.4.2 血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10表達的檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清MVD、HIF-1α、VEGF-A。具體步驟依照試劑盒操作。

1.4.3 滑膜MVD測定 將各組大鼠無菌取雙膝關節滑膜，常規制備石蠟包埋切片，行SABC法染色。采用山羊抗鼠MVD多克隆抗體標記血管內皮細胞(一抗濃度稀釋比例1∶200)，顯微鏡下觀察各組血管新生情況。在×100倍的視野下計數3個微血管密集區的微血管數，取其平均值表示MVD[6]。

1.4.4 滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白檢測 制備滑膜組織蛋白樣品，取15 μg總蛋白上樣電泳、轉膜，封閉、孵育PI3K、AKT、p-AKT、mTOR一抗2 h，分別采用抗羊、小鼠、兔二抗孵育1 h。用增強化學發光法顯色，曝光，沖洗，用掃描儀對膠片進行掃描、攝像；采用圖像分析軟件對條帶進行分析處理，計算各組條帶的灰度值，以條帶與各組內參β-actin灰度值的比值做為滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白的表達量[7]。

2 結果

2.1 足跖腫脹度、關節炎指數的變化 關節炎模型復制前，兩組大鼠關節癥狀差異無統計學意義。致炎后，模型組關節癥狀均明顯高于正常組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠足跖腫脹度及關節炎指數變化

2.2 血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10變化 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、HIF-1α、VEGF-A 明顯升高，IL-10 表達降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

組別鼠數(只)HIF-1αVEGFIL-6IL-10正常組1559.79±9.7865.75±9.3555.70±8.7528.29±7.89模型組1564.34±13.1298.14±12.1779.46±11.3636.43±9.57t值1.0778.1746.4182.542P值0.291<0.001<0.0010.017

2.3 大鼠滑膜血管MVD計數比較 模型組大鼠滑膜組織新生血管豐富、數量多、密集，MVD 明顯高于正常組 (P<0.01)。見圖1。

2．4 大鼠滑膜組織PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR蛋白表達 與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR均升高。見圖2。

A：正常組(SP法,×200)，B：模型組(SP法,×200)，C：正常組和模型組MVD比較(與正常組比較,aP<0.01)

圖1兩組大鼠滑膜血管微血管密度變化

與正常組比較,aP<0.05，bP<0.01

圖2兩組大鼠滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR比較

2．5 相關性分析 相關性分析顯示，HIF-1α與MVD、VEGF-A呈正相關，PI3K與MVD計數、 p-AKT1蛋白呈正相關，PI3K、p-AKT1與VEGF-Α、HIF-1α呈正相關，mTOR與VEGF-A、PI3K、AKT呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 兩組觀察指標的相關性分析(r值)

注： 采用PEARSON相關性分析，aP<0.05

3 討論

PI3K/AKT信號通路激活、HIF-1α、VEGF-Α表達失衡可能是滑膜血管新生的重要因素[8]。PI3K/AKT通路是RA滑膜血管新生的重要調節因子，HIF-1α是調節氧穩態的轉錄因子，能夠調節VEGF-Α表達，進而誘發血管形成和血管通透性增加[9-10]。PI3K /AKT通路過度激活會促使HIF-1α、VEGF-Α表達升高。PI3K/AKT通路和HIF-1α、VEGF-Α表達之間的連系點是mTOR。mTOR是PI3K/AKT下游底物。PI3K/AKT激活mTOR可以調節細胞增殖和生長。

PI3K具有調節細胞新陳代謝、增殖、凋亡的作用。PI3K/AKT通路激活可參與組織細胞炎性反應的增強，并導致低氧環境誘導的滑膜血管的分化、生長，從而發揮其介導參與細胞生長、發育和血管調節作用的生物學效應。PI3K的活化而使AKT 發生磷酸化。AKT是PI3K的效應器，P-AKT通常被認為是PI3K激活的標志。PI3K激活后逐漸激活AKT，活化的AKT能夠促進細胞增殖、抑制凋亡，增加細胞因子的基因表達[11]。因此，PI3K激活AKT過程中滑膜血管新生發生的重要啟動點。同時，滑膜血管生成與HIF-1α、VEGF-Α表達有關。HIF-1α是VEGF-Α激活和滑膜血管新生形成的調節蛋白，HIF-1α的高表達可直接參與滑膜血管新生的形成。HIF-1α可參與滑膜炎的發生、發展過程，HIF-1α表達高低可反映關節炎癥的程度。VEGF-Α、HIF-1α在RA滑膜血管新生中起直接誘導作用。VEGF-Α可致血管內皮細胞分裂、增殖，導致RA血管新生形成。PI3K/AKT通路可調節HIF-1α表達，進而誘導VEGF-Α表達[12]。同時，VEGF-Α的分泌也受PI3K/AKT通路的調節。本研究顯示，AA大鼠滑膜血管PI3K、AKT表達升高，且PI3K、p-AKT與VEGF-Α、HIF-1α呈正相關，而VEGF-Α、HIF-1α表達隨之升高。說明AA大鼠滑膜中PI3K /AKT通路的過度激活可能會上調HIF-1α、VEGF-Α的表達，進而介導的轉錄活動，促進滑膜血管新生形成。本次研究結果與文獻[13-14]研究結論一致。

mTOR對滑膜細胞的增殖分化起作用。滑膜炎癥的進一步增加會使關節腔處于缺氧的微環境中，處于缺氧狀態的滑膜細胞通過新生血管生成，導致滑膜細胞炎性細胞不斷浸潤，惡性循環加重滑膜炎癥和關節炎程度。HIF-1α是缺氧狀態下調控關節腔微環境和滑膜血管新生的關鍵因子[15]。mTOR的激活可以明顯增加HIF-1α蛋白的合成。mTOR在PI3K /AKT通路過度激活后，可引起mTOR通路的激活，從而進一步導致HIF-1α升高，加重滑膜炎癥和滑膜血管新生的形成。研究[16]顯示，mTOR能增強缺氧誘導因子HIF-1α的表達，而HIF-1α表達的增加，會進一步促進與滑膜血管新生密切相關的VEGF-Α表達，加重滑膜血管新生的形成。筆者研究結果發現AA大鼠滑膜血管出現新生變化時，mTOR蛋白表達升高，同時，滑膜血管HIF-1a和VEGF表達升高，相關性分析亦顯示，mTOR與VEGF表達呈正相關。提示mTOR、HIF-1a、VEGF-Α可能共同參與滑膜血管新生的過程。進一步聯系PI3K/AKT蛋白表達發現，mTOR表達與PI3K、AKT蛋白表達呈一定相關性。這說明PI3K/AKT信號傳導通路的過度激活，可能會導致mTOR表達量增加，進而刺激HIF-1a分泌升高，而HIF-1a表達升高會增強其下游基因VEGF-Α等的轉錄活性，促進滑膜新生血管生成。此結果與Lin等[17]研究結論相似。研究[18]表明，mTOR可以增加HIF-1α轉錄活性，增加HIF-1α蛋白表達和合成；mTOR還可促進熱休克蛋白的表達，而熱休克蛋白不但具有刺激滑膜炎性增加的作用，還具有抑制HIF-1α蛋白的功能。

總之，根據以上研究結果，筆者推測mTOR一方面受PI3K/AKT信號通路誘導激活，一方面可以增加滑膜HIF-1α蛋白的合成或抑制其降解，使得HIF-1α蛋白水平增加，導致VEGF-A升高，從而通過促進滑膜新生血管生長，參與滑膜炎癥的過程和血管病變。

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