基質金屬蛋白酶-2在腦膠質瘤細胞中的表達及其分子探針體外磁共振成像的檢測

孫艷,沈靜,單煜恒,鐘士江

(1.中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫院腦科中心，天津 300162;2.中國人民武裝警察部隊安徽總隊醫院神經內科)

腦膠質瘤是原發性人腦腫瘤中的一類惡性疾病，罹患者大多不到5年的生存率，惡性程度高。膠質瘤的治療是世界醫學難題。雖然近年來從手術、化療與放療等手段治療腦膠質瘤取得很大進展，但并未顯著提高其治療效果，很大一部分原因是由于其發病部位位于中樞神經系統，且其相當一部分會浸潤遷移至外周組織[1]。西醫治療(手術、放療、化療)很難達到治愈與控制復發的目的，因此需要了解膠質瘤侵襲的分子機制，特別是其在臨床應用的重要價值。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一種結構中含有鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶類，主要分解細胞外基質蛋白酶類成分，包括發育、組織塑形、炎癥、退行性疾病、腫瘤生長、侵襲與轉移、血管生成等生理病理過程。MMP2是基質金屬蛋白酶家族中的重要亞型[2]。當過表達MMP2時，能促進不同腫瘤的轉移，特別是膠質瘤中的轉移情況。因此有關MMP2的研究就顯得相當重要。但是有關MMP2和膠質瘤的分子研究和影像學研究還需更進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人U251、U373及大鼠C6膠質瘤細胞系購自于中國醫學科學院協和細胞庫，星形膠質細胞系(RA)購自于上海中國科學研究院細胞所。

1.1.2 主要試劑與儀器 (1)試劑：BIO-r-C磁性氧化鐵納米顆粒(USPIO)以Fe3O4為核心，pH值呈中性，其Fe的濃度為3.5 mg/mL，購買自北京萬德高科技發展有限公司。合成USPIO-PEG-MMP2Ab分子探針由廣州銳博生物公司合成。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)、N-羧基琥珀酰亞胺(NHS)；DMEM高糖培養基及FBS胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；普魯士藍染色試劑盒(Perls stain,核固紅法)購于康為世紀(北京)有限公司。(2)儀器：電子顯微鏡(JEM-100CXⅡ，日本)；動態光散射納米粒度儀(Malvern Mastersizer2000，英國)；酶標儀(Eppendorf，德國)；3.0T磁共振掃描儀(Philip，荷蘭)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養、傳代和貯藏 人U251、U373及大鼠C6膠質瘤細胞系、星形膠質細胞系(RA)用DMEM/HIGH GLUCOSE培養基(10%FBS，1%雙抗，1%谷氨酰胺)培養在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。待細胞鋪滿瓶底的80%～90%時用胰蛋白酶法消化傳代。

1.2.2 免疫印跡 RIPA細胞裂解液提取三種腦膠質瘤細胞及星形膠質細胞的總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，后與蛋白等比例加入SDS Loading Buffer，煮沸10 min，進行電泳并半干轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入抗MMP2兔多克隆抗體(1：500)及兔抗人β-action抗體(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗5次，8 分鐘/次，加入含5%脫脂奶粉的封閉液稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗5次，8分鐘/次，滴入顯影液，凝膠成像儀下曝光顯影并采集圖像，以β-actin為內參，實驗重復3次，使用Image Lab軟件進行數據定量分析。

1.2.3 合成USPIO-PEG-MMP2Ab探針 吸取USPIO-PEG(1 mg，3.5 mg Fe/mL)加入2 mL EP管中，稱取1 mg EDC及2.8 mg sulfo-NHS，加入100 μL去離子水溶解后，迅速轉移至USPIO-PEG溶液中，在室溫下反應15 min，采用PD-10交換柱對活化后的USPIO-PEG進行緩沖液交換，洗脫液采用NaHCO3(0.1 M)，然后加入1mg MMP2Ab在室溫下進行偶聯反應，4 h后，PBS緩沖液進行透析并過夜，偶聯完畢后，將偶聯物置于4 ℃冰箱儲存備用，使用前用無菌PBS洗2次，1次5 min。

1.2.4 噻唑藍(MTT)比色法 取對數期生長的RA細胞，以每孔2×104細胞均勻接種至96孔板，完全培養基37 ℃培養24 h，PBS清洗2遍。加入DMEM稀釋的USPIO-PEG-MMP2Ab(0、6.25、12.5、25、50、100 μg Fe/mL)，每組設置3個復孔，37 ℃培養24、48、72 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL用PBS配制pH=7.4)，繼續培養4 h，水平離心機離心后小心棄去上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，避光置于微量振蕩器震蕩15 min，在酶標儀下讀取490 nm處吸光度值。

1.2.5 普魯士藍檢測 取對數期生長的C6細胞，以每孔5×104細胞均勻接種至24孔板，完全培養基培養24 h，PBS清洗2遍。加入200 μL USPIO-PEG-MMP2Ab、BSA、BSA-USPIO，4 ℃孵育2 h后PBS清洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min,每孔加入Perls stain 200μL，室溫靜置30 min后PBS清洗3遍，核固紅復染5 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察。

1.2.6 體外細胞磁共振成像 取對數期生長的C6細胞，以每孔2.5×105細胞均勻接種至12孔板，完全培養基培養24 h，PBS清洗2遍。加入DMEM稀釋的USPIO-PEG及Ab-MMP-2-USPIO(10、20、30、40、50 μg Fe/mL)500 μL，另設置空白對照組。37 ℃培養2 h后，胰酶消化離心，200 μL 1%的低熔點瓊脂糖溶液重懸后加入96孔板中，迅速置于4 ℃得到細胞均勻分布的瓊脂糖凝膠。采用(Philip，Aachieva 3.0T)及人頭線圈行軸位及冠狀位掃描，掃描參數設置如下。T2WI：TR(repetition time)3000 ms，TE(echo time)15 ms，FOV(field of view)180 mm，層厚1.5 mm，層間距：0.5 mm，矩陣180×142，感興趣區(ROI)11.5 mm2。每組取不同層面各測量3次，信號強度(SI)下降計算公式如下：SI下降水平=SI空白-SI測定。

2 結果

2.1 Western-Blot檢測不同腦膠質瘤細胞系中MMP2表達水平 以RA細胞(0.50±0.21)作為對照，結果顯示MMP2在U251(2.19±0.56)、U373(1.65±0.42)、C6(2.31±0.76)均高表達，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

2.2 MTT比色法檢測USPIO-PEG及對細胞生存的影響 RA細胞與不同濃度的USPIO-PEG-MMP2Ab(0、6.25、12.5、25、50、100 μg Fe/mL)孵育24 h后細胞存活率見表1。在磁共振應用的有效濃度范圍內(≤50 μg Fe/mL)，USPIO-PEG-MMP2Ab對細胞存活率無顯著影響，提示其無明顯細胞毒性(P>0.05)；當濃度升至100 μg Fe/mL時，細胞存活率顯著降低，提示存在一定的細胞毒性(P<0.01)。

表1 MTT檢測不同Fe濃度的分子探針對RA細胞存活的影響

注：與Fe濃度為0組比較，aP<0.01

2.3 USPIO-PEG-MMP2Ab與腦膠質瘤細胞的結合

C6細胞與USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab孵育后的普魯士藍染色見圖1。細胞內藍染顆粒較多，主要分布于細胞膜及細胞質中。在相同濃度及孵育時間的條件下，USPIO-PEG-MMP2Ab組的藍染顆粒較USPIO-PEG組更多、更明顯。

圖1 USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab與C6細胞

2.4 USPIO-PEG-MMP2Ab的體外磁共振成像 C6細胞與不同濃度的USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab(0、10、20、30、40、50 μg Fe/mL)孵育2 h后細胞的SI值均出現下降。在相同濃度下，USPIO-PEG-MMP2Ab組細胞的SI值下降水平明顯高于USPIO-PEG組細胞(P<0.01)(見表2)。

表2 C6與USPIO-PEG及USPIO-PEG-MMP2Ab孵育后磁共振成像SI下降值

注：在相同濃度下，USPIO-PEG-MMP2Ab組細胞的SI值下降水平明顯高于USPIO-PEG組細胞，aP<0.01

3 討論

腦膠質瘤約占顱內腫瘤的20%，其生長過快和浸潤性較強的特點造成了其預后差[3]。MMPs在惡性腫瘤浸潤和轉移過程中，參與了細胞外基質和新血管的重構，這主要由于其對底物的親和性，即膠原Ⅳ，纖連蛋白，蛋白聚糖，他們被分泌出來時是處于未激活狀態[4-5]，這一激活過程是通過基質金屬蛋白酶或者絲氨酸蛋白酶來完成。惡性腫瘤細胞侵襲性生長需穿過由基底膜和間質成分構成的細胞外基質，基底膜主要由Ⅳ型膠原蛋白構成，而間質則主要由Ⅰ型膠原蛋白構成。絕大部分腫瘤細胞可產生降解Ⅳ型膠原蛋白的酶。近年來腫瘤基因學治療的發展隨著分子生物學技術的發展亦有較大進步。有研究報道MMP9和MMP12參與腫瘤的轉移[6-8]。膠質瘤的形成和轉移與基質金屬蛋白酶家族中的MMP2有關，但是有關MMP2在膠質瘤中的分子機制還未被研究[9-10]。MMP2參與腫瘤的分子機制可能是通過：(1)通過降解癌細胞或者癌巢周圍細胞外基質，為癌細胞生長和轉移停工良好的環境；(2)在降解細胞外基質的的同時促進血管表皮生長因子，轉錄生長因子等的釋放，通過釋放這些血管生長和細胞轉錄的因子進而到促進癌細胞生長的目的[11-12]。最近有文獻報道MMP2和MMP9與腦出血有關系，該研究表示MMP2/MMP9可能促進了出血后血管源性腦水腫的形成[13-14]。但是其模型是在誘導小鼠形成水腫基礎上進行研究的，所以在臨床上具有一定的參考價值，并沒法說明其實用性。MMP2在影像學中的研究多集中在其是否在臨床患者中的表達情況，其具體研究機制還未清楚。

本實驗首先證實了在多種膠質瘤細胞系(包括人源性和鼠源性膠質瘤細胞系)中，均高表達MMP2，但是在對照組星形膠質細胞系中其表達明顯低于其他腫瘤細胞，統計分析發現差異有統計學意義(P<0.05)。而后，本研究利用碳二亞胺法將MMP2的抗體與超順磁性氧化鐵納米顆粒偶聯合成新型磁共振分子探針USPIO-PEG-MMP2Ab，且對其細胞活力進行檢測，發現其細胞增殖未受影響，緊接著通過普魯士藍染色及體外磁共振成像驗證了新型磁共振分子探針同MMP2高表達的C6細胞的靶向能力，在與單純多肽對照組相比，MMP2靶向性更好(P<0.05)。

本研究顯示，MMP2在膠質瘤中高表達，分子影像學研究表明USPIO探針對高表達MMP2的膠質瘤細胞具有靶向性，為今后在體實驗進一步驗證該磁共振分子探針的成像效果，為其應用于腦膠質瘤早期無創性診斷奠定基礎。

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