細胞DNA倍體分析法在良惡性胸腹水鑒別中的應用價值

劉海軍，梅金紅，王惟佳，徐 姍

(南昌大學第一附屬醫院病理科，南昌 330006)

目前，胸腹水的診斷大多依靠常規脫落細胞學分析法，部分醫院同時使用染色體分析法，但這兩種方法均需要花費醫生大量的時間觀察診斷，而且對診斷醫生的診斷能力及經驗水平要求比較高。有文獻報道胸水中通過細胞學診斷法癌細胞檢出率僅有50%左右[1]，惡性腹水癌細胞檢出率也只有40%[2]，而在基層醫院，由于細胞檢驗醫生的經驗不足或缺乏，其檢出率可能進一步的降低或誤診率增高，而染色體分析法因為對檢測醫生的高要求，一般只在三級甲等醫院有此檢查項目，基層醫院很難開展。近年來，隨著新技術細胞DNA倍體分析法的開展，現已在較多的細胞領域發揮著一定作用，特別是DNA倍體分析對于宮頸癌及其癌前病變的早期診斷及篩查，診斷符合率高，取材方便，檢查簡單無創，是一種較為簡便的普查方法[3]。本實驗通過DNA倍體分析、常規脫落細胞學分析法、染色體分析法的對比，探討其在胸腹水良惡性診斷中的價值。

1 材料與方法

1實驗對象及材料

1.1 研究對象 選擇南昌大學第一附屬醫院2015年7月-2015年12月期間送檢胸腹水標本274例。其中女120例，男154例，最大者92歲，最小者13歲，平均年齡57.3歲。

1.2 實驗試劑 細胞DNA染色試劑 （福建MOTIC公司提供）。巴氏染色液套裝（南昌雨露實實驗器材有限公司）。瑞氏染液（自配：取1g瑞氏染料放置乳缽內，用乳棒磨至細粉末，加少許甲醇溶解再充分研磨，之后再加較多量甲醇研磨，靜置片刻，將上層液體倒入甲醇空瓶，再加甲醇研磨，重復數次，直至乳缽內染料用完為止，之后加甲醇至500ml，搖勻，密封瓶口，存室溫暗處儲存3個月以上）。姬姆薩染液（自配：以1克的姬姆色素染料放入碾缽中，用乳棒磨至細粉末后加入10ml甘油，繼續研磨混勻，之后移入燒杯中，另加甘油至60ml充分混勻，56℃水浴溶解兩小時，再加入60ml甲醇混勻，即配成姬姆色素原液，此原液用前用PBS(PH7.2)稀釋十倍左右就可以使用，就為姬姆薩工作液。工作液可保存1個月左右）KCL，冰醋酸，甲醇，乙醇，二甲苯等。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本的預處理 取胸腹水100ml經3200R/Min離心10min，去上清液取細胞沉淀，如細胞沉淀不能滿足診斷，繼續重復此步驟。之后細胞沉淀分成兩份，一份做常規脫落細胞學及染色體檢查，一份放入胸腹水DNA保存液中2h以上，做DNA倍體分析。

1.3.2 脫落細胞學分析法 制片：取細胞沉淀推片4張，自然涼干，一張固定于95%乙醇中15min以上，之后做巴氏染色，另3張做瑞氏-姬姆薩染色。染色：

1.3.2.1 巴氏染色操作流程 95%乙醇固定(15min)→清水沖洗多次→蘇木素染液 (3-5min)→清水沖洗三次→藍化→95%乙醇漂洗→橙黃染液 (1-10s)→95%乙醇漂洗→95%乙醇漂洗→100%乙醇漂洗→EA50(3-5m)→95%乙醇漂洗→95%乙醇漂洗→無水乙醇漂洗→無水乙醇 (2min)→二甲苯(2min)→中性樹膠封片。

1.3.2.2 瑞-姬染色流程玻片在瑞氏染液浸染（1min）→直接轉移到37℃姬姆薩工作液中浸染（15-25 min）→自來水沖洗→室溫涼干→鏡檢。脫落細胞學分析法閱片：全部染色體片均由兩名副主任以上醫師閱片、判讀。

1.3.3 染色體分析方法 制片：取10ml 0.075mol/L KCL低滲液于細胞沉淀中，混勻，37℃水浴（20min）→加固定液 （冰乙酸 3：1）2ml混勻，預固定（10min）→1500R/Min 離心(10min)，去上清液→加固定液10ml混勻，第一次固定 (30min)→1500R/Min離心(10min)，去上清液→加固定液10ml混勻，第二次固定(30min)→1500R/Min離心(10min)→調節細胞濃度，滴片4張→37℃老化玻片過夜→瑞氏染液浸染（1min）→直接轉移到37℃姬姆薩工作液中浸染（60-90min）→自來水沖洗→室溫涼干→中性樹膠封片→鏡檢。染色體分法析閱片：全部染色體片均由兩名副主任以上醫師閱片、判讀。

1.3.4 DNA倍體分析 制片：標本經保存液固定2h以上后，震蕩混勻，經1500R/MIN離心后去上清液，取細胞懸液制薄層細胞學片，風干，固定。采用Feulgen染色做DNA定量分析。

細胞DNA定量分析[4]：Feulgen染色的涂片采用全自動DNA倍體細胞定量分析檢測儀[MotiCytometer，麥克奧迪（夏門）醫療診斷有限公司]對全片進行掃描，經專門的分析和診斷軟件處理后，可對標本內所有的細胞核內的DNA含量進行定量測定，打印DNA倍體分析直方圖和細胞點陣分布圖，根據診斷軟件所做出的DNA倍體分析結果各處理意見完成檢測報告。所有被檢測細胞中出現指數 （DI）＞2.5的細胞即認為是DNA倍體異常。凡DI＞2.5以上細胞的玻片，必須由細胞學技術員在顯微鏡下逐一對DI＞2.5的細胞進行核實，以排除系統將垃圾和重疊的細胞核誤認為癌細胞或異常細胞。具體分析結果見表1。

表1 DNA倍體分析在胸腹水檢查中判斷方法

1.4 統計方法 實驗結果應用SPSS 19.0統計軟件分析，以率（%）表示，采用 χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常規脫落細胞學分析法、DNA倍體分析法、和染色體分析法檢測結果 見表2，其中染色體檢測法陽性率最高，為40.88%，其112例陽性結果得到病理證實為惡性腫瘤（腺癌86例、淋巴瘤4例、非小細胞型癌4例、鱗癌2例、其他惡性16例），9例可疑結果中2例得到病理證實為惡性，2例為陰性，另5例未得到病理結果證實，患者出院或轉院，實驗結果按陰性病例統計。DNA倍體分析法陽性率為23.36%，16例可疑病例中11例得到病理證實為惡性，3例為陰性，另2例未得到病理證實，實驗結果按陰性病例統計。脫落細胞學分析法陽性率為27.73%，31例可疑病例中16例得到病理證實為惡性，7例為陰性，8例未得到病理證實，實驗結果按陰性病例統計。

2.2 DNA倍體分析法與細胞學分析法和染色體分析法結果評價 實驗結果發現，DNA倍體分析法與細胞分析法比較，差異無統計學意義（χ2=2.49，P＞0.05）；DNA倍體分析法與染色體分析法比較，差異有統計學意義（χ2=12.28，P＜0.05）。染色體分析法陽性準確率較高，達97.44%。以染色體分析法結果為對照，DNA倍體分析法與染色體分析結果特異性為79.20%，敏感性為57.14%；細胞學分析法與染色體分析結果特異性為83.58%；敏感性為67.86%。

表2 DNA倍體分析與染色體分析結果

3 討論

當前，臨床上胸腹水定性診斷可用的方法一般有三種：常規脫落細胞學分析法、染色體分析法和DNA倍體分析法。傳統的方法即為常規脫落學分析法，此方法具有實驗方法簡便，對設備要求不高，但由于診斷細胞學主要是觀察細胞形態變化，因此對醫生的診斷能力存在一定的考量，存在一定的局限性。胸腹水染色體檢查項目雖然診斷陽性率較高，但實驗方法繁雜，對醫生的診斷水平比常規脫落細胞學更高，故其在醫院（特別是基層醫院）推廣到了一定的限制。目前，僅在少許大型醫院開展。DNA倍體分析技術是近年來發展的新技術，并現越來越受到臨床的重視[5-8]，在宮頸癌，乳腺癌，食管癌，口腔腫瘤等多種腫瘤早期診斷中取得了較高的診斷價值[9]。但在胸腹膜腔積液中的研究報道較少。人體90%細胞都處于細胞周期中的靜止期，胸膜腔和腹膜腔表層的間皮細胞都屬于這一期，其DI為1。當間皮細胞處于分裂期時，其DI隨著細胞核內DNA合成和染色體的分離發生變化，但應該都在1-2之間，因此細胞DNA含量變化可以直接反映細胞增殖的能力[10]。惡性胸腹水中的腫瘤細胞具有無限增殖能力，其細胞核DNA的含量明顯增加，測定細胞核DNA含量可以作為判斷惡性胸腹水的客觀依據。本研究共收集274例胸腹水標本，同時使用DNA倍體分析法、常規脫落細胞分析法和染色體分析法檢測，其中染色體分析法準確率最高，達97.44%，以染色體分析法對對照，DNA倍體分析法的特異性為79.20%，敏感性為57.14%，DNA倍體分析法與細胞分析法差異無統計學意義，說明DNA倍體分析法與常規脫落細胞分析法檢測結果相差不大，其結果可以作為診斷良惡性腫瘤提供參考依據。

DNA倍體分析法陰性結果較多，這是因為DNA倍體分析法只能針對腫瘤細胞已經發生DNA倍體改變的腫瘤細胞做出診斷，對DNA倍體未發生改變的二倍體腫瘤檢測呈假陰性[9]。但也有可能是DNA倍體分析細胞量本身不夠，導致假陰性的出現。可疑病例分析中，經病理證實為惡性腫瘤放入陽性病理統計中，因產生胸腹水的原因較多，且炎癥也可能導致細胞發生不典型增生，使細胞產生異型，所以對于病理證實未陰性和沒有病理證實的病例和均放入陰性病例統計中，此分析可能會增加假陰性結果，但如果影像和臨床檢查均沒有證據證明有腫瘤占位性病變，那么胸腹水很可能是非腫瘤性病變，建議此病例隨訪觀察。

綜上對比分析，DNA倍體分析為可以像常規脫落細胞分析一樣，作為胸腹水檢查的輔助檢查手段之一，因其技術要求相對較低，人員培訓時間短，報告時間短等特點，故比其余兩種方法更容易開展。在日常的檢查過程中，也可以一份標本同時做DNA倍體分析及常規脫落細胞學檢查，兩種檢查相互對照，可以大大的提高檢查的陽性率，因DNA倍體分析是全電腦掃描，也可以很大程度的減少閱片醫生的勞動強度。所以，DNA倍體分析法在胸腹水良惡性的判斷中具有一定的價值。

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