結核性腦膜炎實驗室診斷方法及其改進策略

王義義 綜述 張 偉 審校

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis ,TBM)屬于神經系統結核病，是非常嚴重的肺外結核病。TBM病變累及軟腦膜、蛛網膜、腦實質、腦血管，是結核病死亡的主要原因之一，有很高的病死率和致殘率[1]。 TBM預后與診斷早晚以及治療是否及時有密切關系。由于TBM早期臨床表現特異性差，常被誤診為隱球菌性腦膜炎、化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎等疾病而延誤治療，因此臨床診斷困難，病死率和致殘率高。根據文獻[2,3]報道TBM病死率為10%～36.5%。及時診斷，早期治療是改善TBM預后，減少TBM死亡和致殘的重要策略之一，盡早明確診斷是治療成功的關鍵所在。根據2011年世界衛生組織(World Health Organization，WHO)的數據，仍有一大部分TBM的患者沒有得到及時的診斷和治療，因而致殘甚至死亡[4]。TBM的誤診率達到31.6%，早期1周內診斷率僅為10%[1-4]。近年，TBM的實驗室診斷方法取得很多進展，臨床醫生需要了解實驗室檢測方法，提高診斷水平。筆者旨在對目前TBM實驗室診斷方法及改進策略進展進行綜述。

1 病原學檢查

1.1 抗酸染色 抗酸染色，也叫齊-尼染色法，由兩名德國醫師首先描述，已經使用一個多世紀。在結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)鑒定中的作用舉足輕重，但是抗酸染色陽性率低，陽性發現要求的最低菌量為102個/ml，而可靠的陽性發現需要的菌量為104個/ml。TBM是少菌型結核病，腦脊液中的菌量只有100～102個/ml[5]。因此，抗酸染色在TBM診斷中陽性率低，文獻[6]報道只有10%～20%。改進策略主要包括增大腦脊液量，延長鏡檢時間和使用熒光顯微鏡鏡檢。有研究報道，增加腦脊液的檢測量(>6 ml)，延長檢測時間可以提高陽性率到58%[6]。另有研究報道，熒光顯微鏡鏡檢能提高痰液抗酸染色的陽性率，提高10%的敏感度[7]。但是，對于肺外標本，目前還沒有足夠的證據證實熒光檢測的診斷價值。

1.2 結核分枝桿菌培養 TBM患者腦脊液中的Mtb培養敏感度很低，培養時間長。據國外文獻[6, 8]報道，敏感度為36%～81.8%。傳統的固態培養液需要8周培養確定陰性結果。在以肉湯為基礎的培養液中Mtb倍增時間明顯減少(13 dvs26 d)[9]，但是仍需要6周才可確定陰性結果。因此Mtb的培養鑒定只能作為TBM的納入檢驗，而不能作為排除檢驗。為了提高陽性率，有研究報道，延長培養時間至10周可以提高培養的陽性率[10]。為了縮短培養時間，一項來自瑞士的報道，研究了Mtb在雙相培養液中培養結果陽性出現的時間，結果顯示58.3%的培養陽性出現在14 d之內，37.5%出現在21 d之內，4.2%在28 d之內，因此建議Mtb快速培養的時間可以縮短至4周[11]。

1.3 藥物敏感性鏡下檢測分析法 藥物敏感性鏡下檢測分析法(microscopic observation drug susceptibility, MODS)在2000年由 Caviedes等[12]提出。將腦脊液置于含有特異的液體培養液的微孔板中培養，在倒置顯微鏡下觀察，Mtb形成特征性的索樣結構。據文獻[13]報道，腦脊液Mtb培養檢測時間中位數為6 d，敏感度為65%。MODS還可用于藥敏檢查，文獻[14]報道，異煙肼藥敏檢測結果的符合率為95.7%，利福平為96.8%。2011年WHO推薦MODS 作為Mtb培養及耐藥鑒定的方法之一。

2 分子生物學檢查

TBM是一種少菌型的結核病，因此病原學檢查的應用受到限制。分子生物學技術為Mtb的檢測、鑒定和藥敏實驗提供了極大的方便。主要包括聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。臨床最常使用的是核酸擴增實驗(nudeic acid amplification technology, NAATs)。自1990年開始NAATs用于腦脊液標本中Mtb核酸的檢測[15]。NATTs可以檢測到的最低菌量為10個/ml以下的臨床標本[16]。

2.1 聚合酶鏈反應(PCR) 是使用最為普遍的分子生物學檢查方法。可選擇的方法包括實時熒光PCR、環介導等溫擴增法(LAMP)、轉錄介導擴增法(TMA)[17]。對于PCR診斷TBM的敏感度和特異度沒有權威的數據評價，文獻報道差異懸殊。大多數實驗室使用的商業化試劑盒在腦脊液Mtb的檢測中敏感度低，據國外文獻[18]報道為56%。因此PCR不能用于TBM的排除診斷，也不能取代傳統的病原學檢測。

2.2 Xpert MTB/RIF分析(Cepheid,Sunnyvale, CA) 可以在2 h內檢測Mtb基因以及利福平耐藥。檢測過程全自動，只需兩歩人工步驟，手動時間不超過5 min。所檢測標本中最低只需4.5個基因組。2010年WHO推薦Xpert MTB/RIF分析應用于痰液Mtb的檢測。在痰液檢測中敏感度高于抗酸染色(98% vs 68%)。雖然WHO并未推薦其在腦脊液中的應用，但是研究者也在探索Xpert MTB/RIF檢查在腦脊液中的應用，并取得了成果。據文獻[19, 20]報道腦脊液中Xpert MTB/RIF的敏感度為27%～86%。但是由于樣本量小，評估還需要擴大樣本。Xpert MTB/RIF檢測Mtb的同時可以用于利福平耐藥檢測，并被WHO推薦。但是Xpert MTB/RIF分析利福平耐藥的特異性較低，WHO推薦需要用傳統的藥敏實驗排除假陽性的結果[21]。

3 免疫學檢查

3.1 細胞免疫檢測技術 γ-干擾素釋放實驗(Interferon Gamma Release Assay, IGRAs)是在全血中檢測機體對于Mtb抗原的免疫反應，包括測定全血中γ-干擾素的檢測[QuantiFERON-TB?Gold In Tube (QFT-IT);Cellestis Limited Chadstone, Vic., 澳大利亞]以及周圍血單個核細胞的γ-干擾素的檢測(T-SPOT.TB; Oxford Immunotec, Abingdon, 英國)，是一種Mtb感染的細胞免疫檢查。細胞免疫在Mtb感染中發揮主要的作用，當機體感染Mtb時，巨噬細胞通過toll-樣受體(Toll- like receptor, TLR)識別Mtb，通過胞吞控制Mtb。同時巨噬細胞釋放IL-12，誘導T細胞釋放IFN-γ，IFN-γ再刺激巨噬細胞的胞吞以及對于Mtb的氧化性損傷[22]。IGRAs的敏感度高，因此得到廣泛的關注。但是研究表明，IGRAs在診斷活動性結核病中比較結核菌素試驗，并沒有更高的敏感度[23]，不能鑒別結核病是活動性結核病還是潛伏性結核病。在TBM的診斷中，有研究者將其改進，直接檢測腦脊液中IGRAs，用于診斷TBM[24]，檢測腦脊液中IFN-γ的表達可用于TBM的診斷，并取得了令人鼓舞的診斷結果。雖然其敏感度在不同的研究中報道不同[25, 26]，并且該項檢測需要腦脊液量大(6～10 ml)，但是其診斷價值非常值得進一步研究。

3.2 體液免疫檢測 包括Mtb抗原檢測和抗體檢測。抗體檢測方法主要用于檢測結核患者血清中的特異性抗體。目前并沒有取得實質性的進展，沒有研究證據表明抗體檢測有足夠的靈敏度和特異度，并不能作為結核病納入或排除的診斷依據。因此WHO不推薦將結核抗體檢測作為診斷結核病依據[27]。2001年，有研究發現麻風病患者和Mtb致敏的患者體中的T細胞可以識別Mtb6 kD早期分泌蛋白 (ESAT-6)和thologue蛋白[28]。這項發現促進了將Mtb抗原作為結核病診斷標記物的研究，如將MPB-64抗原用于周圍血和尿液標本的檢測、ESAT-6抗原用于腦脊液標本檢測、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)用于尿標本的檢測[29，30]。這些研究都展現出一定的診斷價值，但是目前尚未廣泛用于臨床。

4 生物化學檢查

腦脊液生物化學檢查包括腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme , ACE)等。ADA是用于鑒別TBM與病毒性腦膜炎、化膿性腦膜炎常用的指標之一。ADA是一種核酸分解代謝關鍵酶，在T淋巴細胞中含量最高。ADA的水平與T細胞接受Mtb抗原刺激，產生反應相關。很多研究證實了ADA在TBM診斷中的價值，但是結論有矛盾之處, 且敏感度不高。在一項以病原學確診的TBM患者的研究中，ADA的敏感度為29.9%[31]。腦脊液中臨界值一般定于8 U/L。為了改進ADA在TBM診斷中的靈敏度和特異度，不同的研究探討了ADA的臨界值，改進了ADA的應用，研究的范圍為5.0～15 U/L[32]。不同的臨界值有不同的敏感度和特異度。一項研究提示ADA在1～4 U/L時，其敏感度>93%，特異度 <80%，可用于排除TBM診斷；ADA在4～8 U/L時，既不能確診也不能排除TBM；ADA>8 U/L時, 其敏感度<59%，特異度 >96%，可用于確定TBM診斷。根據ROC曲線分析，ADA理想的臨界值為5.3 U/L (敏感度和特異度均為84%)[33]。

總之，提高TBM的生存率改善預后的關鍵是快速診斷和啟動抗結核治療。在TBM的診斷方面已經取得很大的進展，由于TBM是少菌型結核病，腦脊液中菌量低，限制了一些診斷方法的使用。臨床醫師仍然要通過臨床檢查、腦脊液檢查、影像學改變及評分系統綜合判斷。臨床醫師需要了解各項診斷方法的特征，從而綜合判斷TBM的診斷。