三氮脒含量測定的高效液相色譜法研究

林仙軍， 周芷錦， 羅成江， 王彬，陳曉林

(浙江省獸藥飼料監察所，杭州 311101)

三氮脒為獸醫專用抗原蟲藥[1]，別名貝爾尼、血蟲凈，為重氮胺苯瞇乙酞甘氨酸鹽水合物，對家畜的錐蟲、梨形蟲及邊蟲均有作用[2-4]，用藥后血藥濃度高，維持時間短，治療效果好，預防效果差[5]。三氮脒對家畜的毒性較大[6]，安全范圍較小，可引起副交感神經興奮樣反應，過量使用可引起死亡[7]。三氮脒的質量標準收載于《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部[8]，采用永定滴定法測定含量，專屬性較差，對于符合規定的樣品能夠準確檢測，但對于不純的樣品往往無法準確測定，滴定時不能顯示終點無法檢測或者終點顯示不準確。對三氮脒的研究主要有殘留檢測[9-10]和有關物質[11]，但未見高效液相色譜法測定三氮脒含量的報道。因此，研究高效液相色譜法測定三氮脒的含量，對完善獸藥質量標準有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 Agilent 1260高效液相色譜儀，配DAD檢測器(美國Agilent公司)；AG-285電子天平(Mettler公司)；SL502N電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLER TOLEDO 320酸度計(Mettler公司)；METTLER TOLEDO T50全自動滴定儀(Mettler公司)。

1.2 試劑與藥品 乙腈、甲醇均為色譜純，德國默克公司；磷酸、三乙胺、鹽酸、過氧化氫和氫氧化鈉均為分析純；水為超純水。三氮脒對照品來源為Dr.Ehrenstorfer GmbH，批號G125952，含量88.9%。注射用三氮脒來源為成都中牧生物藥業有限公司，批號為20150901,20150902,20150903，規格為1 g；A企業，批號為160401，規格為1 g。

1.3 對照品溶液和供試品溶液的配制 分別取三氮脒對照品和供試品適量，精密稱定，用5%乙腈溶液超聲溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含20 μg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。

1.4 標準曲線系列溶液的配制 取三氮脒對照品適量，用5%乙腈溶液超聲溶解并稀釋制成每1 mL中含三氮脒100 μg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。取對照品溶液適量，用5%乙腈溶液稀釋成濃度分別為1、2、5、10、20、50和100 μg/mL的溶液。

1.5 高效液相色譜條件和系統適應性試驗 色譜柱：Agilent Zorbax XDB C18內徑4.6 mm，柱長250 mm，粒徑5 μm；檢測波長：370 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相為0.05 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調節pH值至3.0)-乙腈(95∶5,V/V)。

1.6 永停法滴定的方法 取本品1 g,精密稱定，加水20 mL使溶解，加鹽酸溶液(1→2)40 mL，攪拌使溶解，再加溴化鉀2 g，用亞硝酸鈉滴定液(0.1 mol/L)迅速滴定。每1 mL亞硝酸鈉滴定液(0.1 mol/L)相當于51.55 mg的C14H15N7·2C4H7NO3。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及線性關系考察 取1.4項下溶液，按照建立的色譜條件進樣檢測，得到三氮脒對照品溶液色譜圖見圖1。以系列對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，三氮脒在1～100 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，線性方程Y=102.12X-1.4706，相關系數r=0.9998，標準曲線圖見圖2。

圖1 三氮脒對照品溶液(1.三氮脒)Fig 1 Diminazene reference solution (1.diminazene)

圖2 三氮脒標準曲線圖Fig 2 Diminazene standard chart

2.2 穩定性試驗 取批號為20150901的三氮脒供試品溶液，分別于0、2、4、6、12和24 h進行測定，測得三氮脒峰面積分別為2048.15645、2046.13654、2041.56871、2032.56225、2010.11236和2035.66785，表明供試品溶液穩定性良好。

2.3 HPLC法和永停法比較 分別用HPLC法和永停法對實際樣品進行測定，數據見表1。對成都中牧生物藥業有限公司提供的注射用三氮脒進行檢測，批號為20150901,20150902,20150903，三氮脒的含量與永停法一致，相對偏差在0.5%以內。同時對A企業產品，批號為160401，規格為1 g的注射用三氮脒進行了含量測定，HPLC法測定結果為18.4%，峰形良好沒有干擾。而永停法無法顯示終點，含量無法測定。根據后續初步研究，判斷該注射用三氮脒中含有大量多西環素，懷疑多西環素對永停法測定三氮脒產生干擾，導致無法測定的現象發生。

表1 HPLC法與永停法測定含量結果比較(n=3)Tab 1 Comparison of content determination by HPLC method and permanent stop method(n=3)

3 討論和小結

取標準曲線系列溶液中20 μg/mL對照品溶液，在200-400 nm波長范圍內進行DAD掃描。結果三氮脒在370 nm的波長處有最大吸收，見圖3。因此，選擇370 nm作為檢測波長。

圖3 三氮脒DAD掃描圖譜Fig 3 Diminazene DAD scanning pattern

用乙腈-水作為流動相時，三氮脒色譜峰拖尾較為嚴重。在流動相中加入三乙胺、磷酸等改進劑能夠抑制解離，改善峰形。研究考察了0.01、0.025和0.05 mol/L等不同濃度的磷酸溶液，添加三乙胺調節pH值為2.0、2.5、3.0和3.5。結果磷酸濃度低，峰形拖尾較嚴重，磷酸濃度提高，色譜峰拖尾得到改善；pH值對色譜峰影響較小，和金錄勝[11]的研究一致；考察了乙腈的比例對保留時間的影響，乙腈的量5%的時候，保留時間約為10.6分鐘，比較合適。

三氮脒為黃色或橙黃色結晶性粉末，無臭，遇光、遇熱外觀變為橙紅色，但含量保持不變。對三氮脒的穩定性進行了研究，取三氮脒0.1 g，分別加1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過氧化氫溶液各1 mL，放置1 h，依法測定。結果三氮脒在1 mol/L鹽酸溶液中的放置1 h后，溶液無色，含量下降明顯，90%以上已降解；在氫氧化鈉溶液和過氧化氫溶液中溶液顏色橙紅色，含量穩定。其降解產生的雜質均不干擾三氮脒色譜峰。

對含量較低或者存在非法添加物干擾的注射用三氮脒，永停滴定法多數無法準確測定其含量，而高效液相色譜法具有良好的專屬性，能夠準確測定三氮脒的含量，具有明顯的優勢。因此，建立的方法可用于三氮脒的質量控制。

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