UPLC-PDA法測定楊樹花口服液中非法添加物黃芩苷

魏秀麗，張傳津，李有志

(山東省獸藥質量檢驗所，濟南250022)

近年來，獸藥監管部門針對一些不法企業在中獸藥中非法添加化學藥品，組織開展了系列中獸藥中非法添加物檢測方法的研究，對開展非法添加物的篩查、確證工作提供了科學準確的檢測依據，有力打擊了非法造假行為，已取得了初步成效；但是現在市場又出現了一種新的極其隱蔽的獸藥造假行為：一些不法企業為了提高療效，私自調整中藥處方，在原中藥處方中添加處方外的中藥成分，對動物安全同樣帶來潛在危害。山東省獸藥質量檢驗所承擔了山東省和部分外省的非法添加物專項檢測任務[1]，在抽檢的楊樹花口服液中檢出了處方外成分黃芩苷[2]，建立了楊樹花口服液中非法添加物黃芩苷的測定-超高效液相色譜法。研究通過優化流動相梯度洗脫等色譜條件，提高了分離效果，可以作為定性、定量的確證方法，為制定相關標準，以及非法添加物專項任務提供檢驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平：感量0.00001 g；儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀。

1.2 藥品及試劑 黃芩苷，批號110715-201016，含量94.0%，中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：水溶液(0.4%磷酸)，進行梯度洗脫；流速：0.35 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。二極管陣列檢測器，檢測波長為278 nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition table

2.2 樣品制備

2.2.1 陰性樣品5批 5家企業報批的楊樹花口服液經檢驗不含有黃芩苷。待檢的抽檢樣品1批。

2.2.2 標準儲備液的制備 精密稱取黃芩苷對照品10.64 mg，加甲醇至50 mL，制成200 μg/mL的溶液，作為外標儲備液。

2.2.3 標準工作液的制備 取適量標準工作液，用初始比例流動相稀釋，制備成系列濃度為：0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/mL標準工作液，繪制標準曲線。

2.2.4 陽性添加樣品的制備 精密量取黃芩苷儲備液適量，加1 mL楊樹花口服液，置25 mL容量瓶中，配置成的0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL的楊樹花口服液陽添加樣品，加入50%甲醇適量，超聲處理20 min，加入50%甲醇定容搖勻，靜置(或離心)，濾過；取濾液1.6 mL，加初始流動相至10 mL，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，作為陽性添加樣品。陽性樣品和待測樣品同法處理。每個添加濃度制備三份平行樣，每份樣品至少進樣2次，取平均值。報告12個回收率測定結果并計算相對標準偏差(RSD)，見表2。

表2 陽性添加樣品制備表Tab 2 Sample preparation schedule for positive addition

2.3 方法線性考察及添加回收試驗結果

2.3.1 標準曲線 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離黃芩苷，在0.5～100 μg/mL的范圍內標準曲線方程為Y=94800X+10600，Y為黃芩苷峰面積，X為黃芩苷的濃度，其相關系數R2為0.999，線性良好。

2.3.2 方法的檢測限和定量限 陰性樣品經檢測不含黃芩苷，含有防腐劑苯甲酸，楊樹花口服液中添加黃芩苷，液相色譜與苯甲酸分離良好，無其他干擾，添加0.05 mg/mL，信噪比(S/N)>3，確定為方法的檢測限；添加0.1 mg/mL，信噪比(S/N)>10，確定為方法的定量限；根據藥物發生藥效所需要的可能添加的濃度，檢測限和定量限足以滿足要求。

2.3.3 方法的準確度和精密度 楊樹花口服液中添加濃度分別0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL，批內批間變異系數均小于10%，陽性添加樣品的回收率在95%～105%，見表3。準確度和精密度良好，完全滿足檢測需求。

表3 楊樹花口服液中添加黃芩苷的回收率試驗結果(n=12)Tab 3 Test result of recovery rate of baicalin added in yangshuhua koufuye

2.4.4 抽檢樣品的結果判定 空白樣品色譜圖未檢出黃芩苷，黃芩苷對照溶液、抽檢陽性樣品的色譜圖見圖1～圖2，其黃芩苷出峰的保留時間一致，初步判定抽檢樣品添加了黃芩苷；對抽檢陽性樣品光譜圖與黃芩苷對照溶液光譜圖(圖3)進行比較，非常一致，抽檢樣品保留時間4.987 min的色譜峰純度角0.045，純度閾值0.248，純度角小于純度閾值，說明光譜均勻，未包裹共流出物，滿足檢測要求(圖4)，最終確證抽檢樣品非法添加了黃芩苷，通過含量計算，其楊樹花口服液中黃芩苷含量高于15 mg/mL。

圖1 50μg/mL黃芩苷對照品色譜圖Fig 1 50μg/mL Baicalin control chromatogram

圖2 檢出抽檢陽性樣品色譜圖Fig 2 Sampling detection positive sample chromatogram

圖3 黃芩苷光譜圖Fig 3 Baicalin spectorgram

圖4 黃芩苷純度圖Fig 4 Baicalin Purity map

3 討論與結論

3.1 選用超高效液相色譜儀，檢測方法準確經濟快速 本實驗室是在檢測楊樹花口服液中是否含非法添加物時，采用超聲提取法，濾過上機檢測，偶爾發現了非目標峰峰形尖銳，峰面積異乎尋常的巨大，經過眾多的化藥和抗生素光譜圖進行比對發現均不是，后發現其色譜出峰時間和光譜圖與黃芩苷非常一致，然后選擇0.4%磷酸和乙腈為流動相進行方法驗證，選擇超高效液相PDA檢測器，梯度洗脫，與苯甲酸分離度滿足要求，系統適應性良好。用超高效液相色譜運行一針需要10 min，比一般的液相色譜時間節約了30 min，流速為0.35 mL，流動相節約了36.5 mL,不僅減少了實驗室耗能耗電，還減少了廢液排放，符合綠色節能減排的原則。

3.2 色譜柱和柱溫的選擇 一開始選用了ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱，分離效果和峰形較差，后選用了ACQUITY UPLCTMHSS T3色譜柱，使得苯甲酸和黃芩苷分離較好，峰形較好。在柱溫條件優化時，選擇了柱溫30 ℃、35 ℃、40 ℃，比較發現35 ℃效果最好，一是與40 ℃比較，與防腐劑苯甲酸分離度較好，而與30 ℃比較系統壓力相對較小，最終選擇了柱溫35 ℃。通過光譜圖顯示黃芩苷在278 nm 存在最大吸收，故波長選擇278 nm。

3.3 非法添加黃芩苷的潛在風險 黃芩苷是黃芩提取物、雙黃連口服液、銀黃提取物口服液、清解合劑、黃連解毒散、龍膽瀉肝散、郁金散、四黃止痢顆粒等中獸藥中起重要作用的一種組分，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效，用于治療濕熱、瀉痢等；隨著黃芩提取物等中藥良好的治療效果及全國范圍內的推廣應用，其他獸藥中如若再非法添加黃芩苷，有可能造成劑量過大，引起不良反應[2]。

3.4 非法添加物篩查的合理性分析 查資料證實楊樹花水提液中主要化學成分包括多糖、黃酮類、有機酸、強心甙、內酯及香豆素,蒽醌類化合物、酚類或鞣質，植物甾醇等，而且白毛楊雄花序含有多種黃酮類化合物，主要有山奈酚、芹菜素、槲皮素、木犀草素、水楊苷等，但是不含有黃芩苷[3-5]，而且文獻報道楊樹花與黃芩復方研發的注射液對仔豬瀉痢等有良好的協同作用[4]，因此其非法添加符合邏輯規律。

3.5 方法適用范圍及說明 實驗只針對楊樹花口服液中黃芩苷非法添加物的檢測進行了方法學的考察驗證，因為不同樣品背景基質效應差異很大，需要進一步研究其他獸藥單方或復方中黃芩苷的檢測方法，為進一步制訂地方或國家非法添加物質量標準奠定基礎，保障養殖業用藥安全，保障動物食品安全和公共衛生安全。

本方法建立了超高效液相色譜法測定楊樹花口服液中非法添加物黃芩苷，采用外標法，對樣品進行提取稀釋后測定，專屬性強、靈敏度高、檢測限低。通過方法學考察，完全適合楊樹花口服液中黃芩苷非法添加的定性、定量檢測。

[1] 農醫發[2017]2號文農業部關于印發《2017年獸藥質量監督抽檢計劃》的通知 [Z]. 2017.

Agricultural medicine [2017]2 paper on the Ministry of Agriculture issued 2017 quality supervision and sampling of veterinary drugs plan notice [Z]. 2017.

[2] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典2015年版 [S].

China Veterinary Pharmacopoeia Committee. People's Republic of China Veterinary Pharmacopoeia, 2015 edition[S].

[3] 王艷萍，董林，郭世金,等，楊樹花中黃酮類化合物的種類及其藥理作用[J]. 黑龍江畜牧獸醫, 2012，4(2):97-98.

Wang Y P, Dong L, Guo S J,etal. Flavonoids in poplar flower species and Pharmacological action [J]. Heilongjiang animal husbandry and veterinary medicine, 2012,4 (2): 97-98.

[4] 房春林. 楊樹花及其復方制劑藥學與臨床應用研究，四川農業大學博士論文[D].2010.

Fang C L. Study and clinical application of poplar flower and its compound pharmacy, Sichuan Agricultural Uniersity Doctoral Dissertation[D].2010.

[5] 韓立，班付國，周紅霞，等. 高效液相色譜法測定楊樹花口服液中水楊苷的含量[J].中國獸藥雜志，2014(6)：25-27.

Han L, Ban F G, Zhou H X,etal. Determination of salicin in Yanhshuhua oral liquid by HPLC[J]. Chinese Journal of Veterinary, 2014(6)：25-27.