外泌體在前列腺癌發展和轉移中的作用*

吳維，江娟，呂磊，梁嘉前，孫瑩，袁敬東，章傳華，周高峰

（湖北省武漢市第一醫院 泌尿外科，湖北 武漢 430022）

近年來我國男性前列腺癌的發病率和死亡率呈上升趨勢，且我國大多數前列腺癌患者在初診時就已經出現轉移，給臨床治療帶來極大的挑戰[1-3]。外泌體（Exosomes）是細胞通過胞內體內陷形成多泡體再與細胞膜融合釋放，該種細胞脂質雙層膜結構，直徑大約40～100 nm[4]。外泌體攜帶母體細胞特征性生物信息分子（如脂質，蛋白質，DNA，mRNA，miRNA），并可作為細胞間運輸載體將該生物分子傳遞給其他細胞[5-6]，參與多種生物學行為。研究證實，外泌體不僅存在于體外培養的細胞上清中，且大量存在于機體的血液、尿液和唾液等體液和疾病狀態下的胸水、腹水之中[7-9]。其中，外周血中的外泌體與多種疾病如心血管疾病和惡性腫瘤密切相關，并可作為這些疾病診斷的重要潛在標志物[10-12]。本研究的目的是比較正常人和前列腺患者外周血外泌體的含量，并探究外泌體在前列腺癌遠處轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月1日-2016年12月31日于武漢市第一醫院泌尿外科就診的前列腺癌患者16例。手術切除16例前列腺癌標本及相應瘤旁組織，所有標本均由2位病理醫師獨立診斷，并結合患者臨床表現、影像學及組織學特點確診。患者年齡54～72歲，中位年齡61.81歲。所有患者均無飲酒愛好，多數患者無吸煙愛好。標本獲取前均告知患者并簽署知情同意書，研究方案經武漢市第一醫院倫理委員會批準。

1.2 外泌體檢測

1.2.1 材料和設備 DMEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）及雙抗（青霉素+鏈霉素）、胰蛋白酶（購自美國Hyclone公司），MTT、DAPI封片劑（購自武漢谷歌生物科技有限公司），Ki-67、CD63、CD9、GAPDH一抗（購自美國Sigma公司），細胞培養耗材（購自無錫耐思生物科技有限公司）。

1.2.2 外泌體的分離與純化 用含抗凝劑的真空采血管收集前列腺癌者5 ml靜脈血樣品；并轉移至離心管中，4℃條件下，1 000 r/min離心20 min，取上清液，加入上清體積3倍的無菌PBS稀釋血清；4℃條件下4 600 r/min離心20 min；取上清液，并將上清液以0.2 μm濾器過濾，最后4℃條件下34 000 r/min離心70 min，得到沉淀，并以150 μl無菌PBS重懸沉淀，即獲得外泌體。以BCA法測定外泌體蛋白濃度，置于-80℃冰箱冷凍保存備用。收集細胞培養上清，以上述離心方法收集細胞上清中外泌體。

1.2.3 外泌體形態表征 取10 μl外泌體PBS垂懸液滴于碳支持膜銅網上，室溫孵育5 min，濾紙吸干銅網；將銅網置于1%磷鎢酸復染液中染色，3 min后濾紙吸干液體，自然晾干銅網；將銅網置于Hitachi HT7700型透射電鏡上觀察、拍照，測量外泌體粒徑大小。將PBS重懸的外泌體樣品吸附至鎳網上，自然風干；2.5%的戊二醛固定10 min，PBS漂洗3次；加入CD63抗體20 ml（1∶100）或CD9抗體20 ml（1∶100）于37℃孵育2 h，PBS漂洗3次，加入金標二抗20 ml（1∶100）于37℃孵育1 h，PBS漂洗3次；醋酸鈾負染5 min，以濾紙吸干染液；待樣品干燥后置于透射電鏡下觀察。

1.2.4 Western blot 收集蛋白，并用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。按所測蛋白濃度計算樣品（蛋白上樣量為20 μg）和上樣緩沖液體積后，將其混合并置于95℃水浴鍋中水浴5 min。配制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），80 V恒壓下蛋白電泳至分離膠與濃縮膠界面時換為120 V電壓，然后200 mA，2 h恒流下將蛋白轉至PVDF膜。封閉2 h后，分別以 CD63（1∶ 1 000）、CD9（1∶ 1 000）、Cyclin D1（1 ∶ 1 000）、phospho-Rb（pRb，1 ∶ 1 000）、GAPDH（1∶10 000）抗體4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。相應二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。化學發光劑顯色后，蛋白凝膠成像系統分析樣品中目標蛋白的相對含量。

1.2.5 細胞培養 前列腺細胞系LNCap細胞來源于中國典型培養物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）。LNCap細胞培養于含10%FBS的DMEM培養基中，隔天換液，每3天傳代1次；細胞培養環境為37℃、約95%濕度、5%二氧化碳CO2濃度。

1.2.6 MTT實驗 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度加入96孔板：每孔加入100 μl，使細胞調密度1 000～10 000/孔。細胞分為對照組和實驗組，實驗組細胞分別加入終濃度為5、10和15 μg/ml前列腺癌患者來源的外泌體。5% CO2，37℃孵育0～72 h，每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續培養4 h。終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值，并與對照組0 h的吸光度值比較。

1.2.7 細胞活力檢測 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度加入12孔板：每孔加入2 ml，使細胞調密度5×105/孔。細胞分為對照組和實驗組，實驗組細胞分別加入終濃度為15 μg/ml前列腺癌患者來源的外泌體。5% CO2，37℃孵育24 h，終止培養，小心吸去孔內培養液，消化細胞，細胞活力儀器檢測細胞活力。

1.2.8 免疫組織化學染色 標本取材后切成小塊組織，4%多聚甲醛固定標本、流水沖洗后，梯度酒精脫水、石蠟包埋及組織切片（4 μm）。然后二甲苯脫蠟、梯度酒精入水、高壓抗原修復、羊血清37℃孵育切片20 min，甩去血清，滴加CD63一抗（1∶200），4℃孵育過夜。滴加相應辣根過氧化物酶標記的二抗約50 μl完全覆蓋切片，37℃孵育切片20 min。PBS緩沖液漂洗后，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，37℃孵育切片20 min。PBS緩沖液漂洗后，于光學顯微鏡下顯色。蘇木素復染細胞核后流水沖洗15 min后，梯度酒精脫水，切片晾干后行二甲苯透明及中性樹膠封片過夜。光學顯微鏡隨機拍攝5個高倍視野（×200）/張切片，利用Image-Pro Plus軟件統計CD63著色強度。染色評分由2位經驗豐富的病理醫師進行雙盲閱片完成，取其平均值。

1.2.9 外泌體對前列腺癌肺轉移模鼠的影響 將對數生長期的LNCap細胞以PBS重懸，使細胞密度為1×107個/ml。將200 μl含有細胞的PBS懸液經尾靜脈注入裸鼠體內（每組各10只）。實驗組老鼠，每3天經尾靜脈注射1次外泌體（50 μg/次），連續注射3次。觀察期結束后，安樂死動物，收獲肺組織切片脫蠟、梯度酒精入水后，滴加適量ki-67（鼠源）和CD-63（兔源）一抗，37℃孵育1 h；PBS洗去抗體；滴加適量對應二抗，37℃避光孵育30 min，PBS洗去抗體；以含DAPI封片劑封片；最后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照成像。

1.3 統計學方法

數據分析采用GraphPad Prism 6.0軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩兩比較用t檢驗，3組及3組以上采用單因素方差分析（One-way-ANOVA）及重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體的分離和鑒定

按圖1A所示的程序，離心法收集前列腺患者外周血中的外泌體。將離心所得沉淀以PBS垂懸后，置于透射電鏡下觀察：分離所得的沉淀呈雙層膜結構，大小范圍為20～100 nm，其中30～60 nm的雙層膜結構最多（見圖1B）。Western blot結果提示，離心分離的沉淀中高表達CD63和CD9（見圖1C）。免疫電鏡結果進一步提示，CD63、CD9表達的位置位于雙側膜結構外膜（見圖1D）。上述鑒定結果顯示分離所得的沉淀的粒徑分布范圍和表面標志分子的表達均與報道的文獻結果一致[13]，證明本研究分離所得的沉淀為外泌體。

2.2 前列腺癌患者外周血外泌體水平

分別收集正常人和前列腺癌患者外周血外泌體，以BCA法測定外泌體總蛋白含量。結果發現，前列腺癌患者外泌體含量為（27.69±11.66）μg/ml，高于正常人外周血中外泌體含量（7.41±5.2）μg/ml（見圖2A），差異有統計學意義（t=6.313，P=0.000）。16例前列腺癌患者分為無遠處轉移（n=6）和伴發遠處轉移（n=10）兩組，并進一步分析兩組患者外周血外泌體含量。見圖2B所示，伴遠處轉移的前列腺癌患者外周血中外泌體含量（33.40±10.45）μg/ml＜無遠處轉移前列腺癌患者外周血中外泌體含量（18.17±5.96）μg/ml，差異有統計學意義（t=3.055，P=0.0086）。以上結果提示外泌體可能在前列腺癌的進展中起重要作用。同時，前列腺癌中CD63組織學評分（2.04±0.61）高于癌旁正常前列腺組織組織學評分（0.55±0.21），差異有統計意義（t=3.870，P=0.000）。見圖2C、2D。

2.3 前列腺癌患者外泌體對前列腺癌細胞增殖和外泌體分泌的影響

為進一步研究外泌體在前列腺發展中的作用，評估外泌體對前列腺癌細胞活力和增殖能力的影響。實驗組和對照組數據的方差分析，結果：不同濃度外泌體處理24 h后細胞活力無差異（F=0.360，P=0.836）（見圖3A），不同濃度的外泌體對細胞活力無影響。MTT實驗證實，不同濃度處理后的細胞增殖活性有差異（F=0.650，P=0.018）。實驗組間細胞增殖活性有差異（F=0.845，P=0.025），外泌體濃度越高，細胞增殖活性越高。實驗組和對照組細胞增殖活性變化趨勢有差異（F=0.576，P=0.015），見圖 2B。

圖1 前列腺癌患者外周血外泌體的分離和鑒定

圖2 前列腺癌患者外周血外泌體含量

Western blot實驗顯示 Cyclin D1（F=0.725，P=0.027）和 pRb（F=0.618，P=0.015）高于對照組細胞。實驗組間細胞增殖活性有差異（F=0.320，P=0.014），外泌體濃度越高，Cyclin D1和pRb表達水平越高。實驗組和對照組細胞增殖活性變化趨勢有差異（F=0.576，P=0.015），見圖3B、3C。收集外泌體處理組和對照組細胞培養上清液，并分離上清中外泌體。BCA測定外泌體總蛋白后發現，外泌體處理組細胞外泌體分泌量大于對照組細胞外泌體產量（F=0.451，P=0.027）（見圖3D），且促進作用具有濃度依賴性。

2.4 外泌體對前列腺癌肺轉移裸鼠的影響

注射外泌體組裸鼠肺部轉移灶數目（16.28±6.94）多于對照組（4.72±2.51）差異有統計學意義（t=5.265，P=0.000）（見圖4A、B）。肺組織切片H&E染色結果進一步證實，單位面積內肺轉移灶面積大于對照組（見圖4C）。外泌體處理組裸鼠存活時間較對照組組裸鼠存活時間短，差異有統計學意義（見圖4D）（χ2=6.606，P=0.000）。肺轉移灶免疫熒光分析結果顯示，外泌體處理組轉移瘤標本中CD63和Ki-67表達水平高于對照組（見圖5A、B），差異有統計學意義（t=4.238，P=0.0067）。

圖3 前列腺癌患者外泌體對前列腺癌細胞增殖和外泌體分泌的影響

圖4 前列腺癌患者外泌體對前列腺癌肺轉移裸鼠的影響

圖5 肺轉移灶中CD63和Ki-67的表達

圖6 外泌體在前列腺癌發展和轉移中的作用

3 討論

盡管外泌體最初在1983年就被發現，但人們一直認為它只是一種細胞的廢棄物[14]。然而最近幾年，人們發現這種微小膜泡中含有細胞特異的蛋白、脂質和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能。該發現點燃了人們對細胞分泌膜泡的興趣。最近的研究發現外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等。不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。近期有學者報道，乳腺癌細胞來源的外泌體可在肺部或肝部形成利于乳腺癌細胞生成的微環境，為迎接癌細胞向上述器官轉移鋪平道路[15]。說明外泌體在腫瘤轉移中起前鋒作用。我國大多數前列腺癌患者在初診時就已經出現轉移，遠處轉移最常見于骨轉移和肺轉移。前列腺癌細胞來源的外泌體在前列腺癌的遠處轉移中是否起作用作用目前尚無文獻報道。

本研究結果顯示，前列腺癌患者外周血外泌體濃度高于正常人。此外，伴遠處轉移的前列腺癌患者外周血中外泌體的含量對于無遠處轉移前列腺癌患者。提示外泌體可能在前列腺癌的發生和發展中起重要作用。并且前列腺癌患者外周血外泌體可以提高前列腺癌細胞的增殖活性。隨后在肺轉移模型中發現，前列腺癌患者來源的外泌體在裸鼠體內可促進前列腺癌細胞的肺轉移。該結果可解釋伴遠處轉移的前列腺患者外周血中外泌體的含量高于無遠處轉移的前列腺癌患者。同時，上述結果還顯示，外泌體可促進前列腺癌的發展，并加速前列腺癌的遠處轉移。此外，還發現，前列腺癌患者來源的外泌體還可以提高前列腺癌細胞分泌外泌體的能力，促進前列腺癌細胞分泌更多的外泌體。筆者推測，外泌體分泌的增加，導致患者外周血中外泌體含量的進步一提高，從而進一步促進前列腺癌的發展和轉移，并誘使細胞分泌更多的外泌體，形成1個正反饋環（見圖6），最終導致前列腺癌發展加速和遠處轉移的形成。

總之，本研究發現：①前列腺癌患者外周血外泌體含量高于正常人；②伴遠處轉移的前列腺癌患者外泌體含量高于無遠處轉移前列腺患者；③外泌體促進前列腺細胞增殖和外泌體分泌；④外泌體促進前列腺癌的遠處轉移。本研究的結果有助于理解前列腺癌的發生、發展以及轉移轉移的機制，以期尋找更好的治療方法。

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