缺氧誘導因子1α與甘氨酸甲基轉移酶在胃癌組織中的表達及其臨床意義

達熱拜·熱達提，趙為民，曾祥岳，楊新輝

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011）

胃癌是全世界范圍內都較為常見的惡性腫瘤[1]，在任何年齡段都可能發生，且多見于40～60歲，男性多于女性。這可能與社會的發展使得人們的飲食結構發生不同程度的改變及不良生活習慣等有關，確切的誘發病因至今不明。目前胃癌治療的主要方案為外科手術，但由于大多數早期胃癌患者其身體并無癥狀，只有少數會有嘔吐、惡性或是類似于上消化道潰瘍病癥狀的表現[2]。一旦發現出現體重減輕或身體疼痛時，多數患者已經發展到進展期，對人們的生活和健康構成嚴重威脅[3]，因此，發現對早期胃癌防治及預后能產生有效特異性標志物顯得尤為重要。本研究缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和甘氨酸甲基轉移酶（glycine methyltransferase，GNMT）在胃癌組織中和癌旁正常組織的表達及與患者預后關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年6月-2016年6月本院收治的45例的胃癌患者為觀察對象。分別采集患者胃癌組織與癌旁正常組織標本。其中，男性28例，女性17例；年齡28～78歲，平均（58.34±9.28）歲；腫瘤位置：噴門6例，胃底8例，胃體4例，胃竇27例；腫瘤大小：＜6 cm 23例，≥6 cm 22例；分化程度：高分化12例，中分化25例，低分化8例；T分期：T1+T225例，T3+T420例；淋巴轉移：有21例，無24例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ 29例，Ⅲ+Ⅳ 16例。入選標準：①患者均確診為胃癌；②術前未進行放化療等；③所有病患或其家屬均知情并簽字同意參與研究。排除標準：①術前有放化療治療；②拒絕參與研究的患者。所有患者均簽署知情同意書，本文獲得我院倫理委員會審核并批準。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR） 提取標本組織RNA，采用購自Invitrogen公司的Trizol試劑，嚴格按照說明書操作。將組織樣本置入EP管中（內含無RNA酶2 ml），并將1 ml Trizol加入管中，在液氮中研磨后于常溫中靜置5 min后將0.2 ml氯仿滴入管中并搖晃15 s，然后繼續靜置10 min（常溫）。以12 000 r/min進行15 min離心（溫度為4℃），將上清液分離出加入新的EP管（內含無RNA酶1.5 ml），并將0.5 ml異丙醇加入管中并混合均勻后常溫下靜置3 min，再以12 000 r/min進行15 min離心（溫度為4℃）后將上清液倒掉，加入1 ml乙醇（濃度為75%）對RNA沉淀進行洗滌。再以12 000 r/min進行8 min離心（溫度為4℃）后將上清液倒掉，乙醇完全揮發后將高溫滅菌后的50 μl MiliQ純水（焦碳酸二乙酯對其進行處理）。采用逆轉試劑將mRNA逆轉為cDNA（購自Toyobo公司），采用7900HT序列儀將cDNA進行qRT-PCR（購自美國生物公司），每個樣本進行3次重復試驗，算出其相對值。

1.2.2 提取蛋白并行Western blot檢測 使用RIPA裂解法提取蛋白，裂解時為降低蛋白降解速度加入PMSF等蛋白酶的抑制劑。將裂解物以12 000 r/min進行10 min離心（溫度為4℃）后分離上清液并對其蛋白總濃度進行測定，BCA試劑盒購于碧云天生物。將3×蛋白緩沖液適量加入裂解液中，行10 mim沸水浴后蛋白變性，行膠上電泳后將蛋白置于PVDF膜上。用TBST制成脫脂牛奶（濃度為5%）中封閉保存PVDF膜1 h，將封閉液洗干凈后孵育HIF-1α抗體（購自Abcam公司，濃度為1∶1 500）。在4℃冰箱冷凍保存12 h以上，進行清洗并繼續孵育1 h（用兔二抗），進行清洗后用濃度為1∶3 000的GAPDH進行顯影（購自Vazyme公司）。用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）對癌組織以及旁邊組織GNMT表達。用GNMT的引物序列經PCR儀器增加，并計算其相對值。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 用購于聯世科技的ELISA試劑盒對GNMT進行檢測，嚴格按照試劑說明書在各個孔中分別加入樣品，并恒溫（37℃）孵育2 h后將試劑A加入其中后繼續孵育1 h，將反應液吸出后洗滌3次后將試劑B加入其中，恒溫（37℃）孵育30 min，將反應液吸出后洗滌5次后將90 μl反應物底物加入繼續恒溫（37℃）孵育20 min，將50 μl終止液加入并進行吸光度檢測。

1.3 效果評價

染色以及免疫組織化學（免疫組化）結果判斷：將樣本制成芯片后對其進行相關處理（脫蠟和水化），用濃度為3%的H2O2對其過氧化物酶進行滅活（常溫下密閉10 min），并與高溫高壓下恢復抗原熱，將抗原抗體反應（非特異性）經牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）進行封閉；將購自Abcam公司，濃度為1∶300的HIF-1α以及其公司生產的濃度為1∶400的CD34加入后在4℃下進行過夜孵育；給予磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進行洗滌，孵育兔二抗，常溫下保持30 min用PBS進行洗滌；進行5～10 min避光顯色后終止顯色（用自來水洗滌）。陽性百分率的評判標準如下[4]：0分為細胞無著色；1分為細胞著色≤ 25%；2分為細胞著色范圍在26%～74%；3分為細胞著色＞75%。染色強度的評判：無著色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。陰性表達：陽性百分率×染色強度≤2分，陽性表達：陽性百分率×染色強度＞2分。將陽性百分比和染色強度的評分結果相乘，即為綜合評分，用判定陽性表達強度，綜合評分0～1分判定為表達陰性（-），2～5分判定為表達弱陽性（+），6～8分判定為表達中度陽性（++），9分判定為表達強陽性（+++）。

1.4 統計學方法

數據處理采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較做χ2檢驗。影響胃癌患者5年生存結局的多因素生存分析采用Cox比例風險回歸模型，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織和癌旁正常組織中HIF-1α的表達

HIF-1α在胃癌組織中的陽性率為84.44%，高于癌旁正常組織的陽性率4.45%；HIF-1α在胃癌組織胞核的陽性率為64.44%，高于胞質的陽性率20.00%。見表1和圖1、2。

2.2 GNMT在胃癌組織及癌旁組織的表達

GNMT在胃癌組織（678.23±221.88）ng/ml的表達低于癌旁正常組織（1136.73±332.81）ng/ml，差異有統計學意義（t=7.689，P=0.000）。GNMT在胃癌組織的表達低于癌旁正常組織（P＜0.05）。

表1 胃癌組織和癌旁正常組織中HIF-1α胞核陽性率及胞質陽性率的比較 （n =45）

圖1 胃癌組織胞核中HIF-1α表達陽性 （免疫組化）

圖2 胃癌組織胞質中HIF-1α表達陽性 （免疫組化）

2.3 患者5年生存結局的獨立因素分析

多因素Cox回歸分析顯示，影響胃癌患者5年生存結局的獨立因素包括HIF-1α蛋白（+）表達（P=0.002）、GNMT蛋白（-）表達（P =0.006）、分化程度（P=0.036）、浸潤深度（P =0.001)和遠處轉移（P =0.002）。見表 2。

3 討論

胃癌發病率在消化系統腫瘤中占據40%～50%比例，發病率與致殘率在惡性腫瘤中占比最高[5-7]。胃癌的治療目前為放化療、手術及中醫措施和對患者免疫力進行提升等綜合療法，由于胃癌患者一旦發現絕大部分是已屬發展期[8-10]，且具有較為復雜的分化、組織成分及生物型行為，療效滿意度低，為此如何有效防治胃癌成為醫療工作者研究的重點和焦點。找尋特異而又敏感的腫瘤分子類標志，在基因以及分子水平對胃癌進行生物學檢測，更深層次的對胃癌發病機制進行了解，能提高早期診斷率，從而及早制定方案并改善患者預后[11]。

本文HIF-1α在胃癌組織胞核的表達陽性率高于胞質的陽性率，且均高于癌旁正常組織中胞核和胞質的陽性率。表明HIF-1α的表達主要集中存在于胃癌組織的胞核與胞質，說明HIF-1α進入胞核才能對調控血管內皮中的生長因子產生作用，進而調控基質金屬酶的表達，對腫瘤細胞發生轉移及浸潤產生影響[12-13]。HIF-1α在胃癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，而GNMT胃癌組織中的表達低于癌旁正常組織。表明HIF-1α與GNMT對胃癌組織與癌旁正常組織表達之間差異較大，臨床可通過檢測患者HIF-1α與GNMT表達來對胃癌進行評估。GNMT作為多功能的一種蛋白質在人體內能參與到致癌環境物質代謝過程中起到解毒作用，GNMT作為多環芳烴與蛋白相結合物質在解毒途中對化學物質進行截獲，能有效抑制腫瘤[14]。有報道稱，GNMT減少表明腫瘤感性物會有所增加，提示GNMT在腫瘤發病機制中也發揮著作用[15]。本研究還發現，在胃癌預后單或多因素分析中，性別、年齡及位置無差異，與分化程度、T分期及淋巴轉移等比較均有差異，表明胞核HIF-1α表達是危險因子，且對預后不會產生獨立作用。有報道表明，胃癌組織中GNMT表達與TNM腫塊呈負相關，與分化程度呈正相關，由此得出GNMT與胃癌的發病進展具有相關性。

綜上所述，HIF-1α與GNMT在胃癌組織中高表達，并且與胃癌預后有關系，可作為預測胃癌患者預后的重要指標之一，不過還有待大量的實驗來驗證。

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