甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅢ基因表達分析

黃誠梅， 楊翠芳，， 魏源文， 鄧智年， 吳凱朝， 曹輝慶， 李楊瑞，

(1.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西南寧 530007； 2.中國農業科學院甘蔗研究中心/農業部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530007)

甘蔗蔗糖積累過程是甘蔗最重要的代謝途徑，與甘蔗產量和品質形成密切相關。甘蔗蔗糖積累過程主要涉及蔗糖合成酶(sucrose synthase，簡稱SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，簡稱SPS)、可溶性酸性轉化酶(acid invertase，簡稱AI)和中性轉化酶(neutral invertase，簡稱NI)等，與蔗糖合成和分解反應密切相關[1-2]。SPS在蔗糖代謝中被認為是控制蔗糖合成的一個關鍵酶，其活性不僅能影響蔗糖的合成能力，還影響光合同化碳的分配和糖分積累[1-6]。Langenk?mper等用生物信息學方法對高等植物已知的SPS基因的全長序列和其保守序列進行分析，把SPS基因分為A、B、C這3個家族[7]。但Castleden等對小麥等單子葉植物的SPS基因進行研究后發現，單子葉植物中的SPS基因分為5個家族，除了存在A(Ⅱ)、B(Ⅴ)、C(Ⅰ)家族外，還包括D(Ⅲ)和D(Ⅳ)家族[8]。目前，從美國國家生物技術信息中心網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上檢索可知，已經從玉米[9]、菠菜[10]、甜菜[11]、柑橘[12]、蘋果[13]、水稻[14]、甘蔗[15]、馬鈴薯[16]等作物中克隆到SPS基因。

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是最主要的糖料作物，蔗糖占世界食糖總產量的76%，占我國食糖總產量的90%以上。作為C4高生物量和高纖維作物，甘蔗是一種理想的能源作物。蔗糖代謝是甘蔗生長發育過程中最重要的代謝途徑。甘蔗SPS基因SPSⅡ于1997年被成功克隆[15]，近年來，甘蔗SPS基因家族的其他成員也先后被成功克隆，如SPSⅡ(EU269038.1)、SPSⅢ(EU278618.1、EU278617.1)、SPSA(HM854011.1)、SPSB(JN584485.1、HQ117935.1)。但到目前為止，對甘蔗SPS基因家族的功能及表達特性等方面的研究報道仍然較少。利用已克隆的甘蔗SPSⅢ cDNA片段，通過半定量RT-PCR方法對SPSⅢ在工藝成熟期中甘蔗不同基因型及其不同部位中的表達差異進行分析，為進一步研究SPSⅢ的表達特性及其在甘蔗蔗糖代謝中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

供試甘蔗材料包括桂糖28號(GT28)、果蔗Badila、新臺糖20號(ROC20)、新臺糖22號(ROC22)，均由廣西農業科學院廣西遺傳改良生物技術重點開放實驗室提供。

甘蔗總RNA提取世紀Trizol購自Invitrogen公司；Ex-Taq酶、dNTPs Mixture、DNA Maker、載體pMD-18-T-Vector、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、X-Gal等均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR擴增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；所用的菌株為筆者所在實驗室保存的大腸桿菌JM109，小量膠回收試劑盒購自上海華禹生物工程有限公司；其他試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 植物材料的種植與取樣

試驗在廣西農業科學院溫室大棚進行，采用口徑為 35 cm、桶底直徑為28 cm的黑色塑料桶裝沙質土壤進行桶栽，每桶4～6芽，齊苗后定苗，每桶2～3株，其余管理措施與一般桶栽試驗的管理措施相同。于甘蔗生長后期、工藝成熟初期進行取樣，每個甘蔗基因型選取生長比較一致的5株植株，取+1、0葉、嫩葉鞘、幼莖(最高可見肥厚帶的第1張完全展開葉為+1葉，自下而上位于+1葉之上的為0葉，自上往下數位于+1葉下面的為+2葉，依此類推[17])。葉片選用距葉環20～60 cm區段，去除中脈后立即放于液氮中，混勻分裝保存用于總RNA的提取。

1.3 引物設計

根據NCBI的GenBank與DDBJ數據庫中的甘蔗SPS基因核酸序列，采用生物學軟件Primer Premier 5.0分析設計半定量RT-PCR的特異性引物，引物序列為SF2：5′-GGGAGGAGAAGGACTAAGGA-3′和SR2：5′-GCAAGACAA TAGGCTGAAGAG-3′。內參基因引物參考甘蔗的看家基因25S rRNA的實時PCR引物[18]，引物序列為RF2：5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′和RR2：5′-CCTATTGGTGG GTGAACAATCC-3′。

1.4 甘蔗總RNA提取及cDNA第1鏈合成

參照Invitrogen的Trizol方法[19]提取甘蔗各部位的總RNA。取各個部位的總RNA 500 ng，用TaKaRa公司的AMV Reverse Transcriptase XL反轉錄酶進行反轉錄合成cDNA第1鏈，反應后將cDNA凍置-20 ℃備用。

1.5 甘蔗SPSⅢ基因半定量RT-PCR分析

以甘蔗工藝成熟期各基因型各個部位的cDNA第1鏈為模板，以目的基因SPSⅢ引物及內參基因25S rRNA的引物進行半定量RT-PCR擴增，分析SPSⅢ的表達情況。25 μL PCR反應體系為10×Ex-TaqBuffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.0 μL、10 pmol/μL前引物1.0 μL、10 pmol/μL 后引物1.0 μL，模板cDNA第1鏈1.0 μL，5 U/μL Ex-Taq酶 0.2 μL，ddH2O補足至25.0 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，50～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。反應完成后，取5 μL擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 甘蔗各個部位總RNA的提取及其cDNA第1鏈的合成

由圖1可見，4個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖4個不同部位采用Trizol法提取得到的總RNA經電泳檢測，2條主帶28S與18S清晰完整，沒有明顯的拖尾現象。RNA濃度及其純度檢測表明，D260 nm/D230 nm比值大于2.0，D260 nm/D280 nm比值在1.8～1.9之間。以500 ng總RNA進行cDNA第1鏈合成，以進行下一步的半定量PCR擴增。

2.2 甘蔗工藝成熟初期SPSⅢ基因表達分析

在甘蔗工藝成熟初期，SPSⅢ在4個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中均已有表達，但SPSⅢ表達因甘蔗基因型不同而有所差異(圖2)。GT28的4個部位中，在+1葉中表達量較高，0葉、嫩葉鞘和幼莖的表達量都很低；在果蔗Badila的4個部位中表達量差異不大，以0葉的表達量最高；在ROC20中以嫩葉鞘中的表達量最高；而在ROC22中以幼莖中表達量最高。由此可見， 不同基因型的SPSⅢ表達情況存在差異。

2.3 甘蔗工藝成熟中期SPSⅢ基因表達分析

由圖3可見，在甘蔗工藝成熟中期，SPSⅢ在4個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的表達量較初期沒有明顯差異。在果蔗Badila 4個部位中的表達量稍高于其他3個品種，而在GT28的4個部位中表達量最低；ROC20與ROC22的4個部位中均以在嫩葉鞘中的表達量較高，其次為+1葉。

2.4 甘蔗工藝成熟后期SPSⅢ基因表達分析

由圖4可見，在甘蔗工藝成熟后期，SPSⅢ在4個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的表達量較前2個時期迅速提高，均達到了較高的表達水平，尤其是在GT28、果蔗Badila和ROC20中，而在ROC22的0葉、幼嫩葉鞘2個部位中表達量較低。其中，SPSⅢ基因在GT28的4個部位中表達較前2個時期迅速提高，+1葉、0葉、嫩葉鞘、幼莖的表達水平相當；SPSⅢ基因在果蔗Badila的幼莖中表達量稍弱外，其他3個部位的表達水平均較高；SPSⅢ在高糖品種ROC20的幼莖中表達量較其他3個部位的高；而在ROC22的+1葉與幼莖中表達量較0葉與嫩葉鞘高。結果表明，在甘蔗工藝成熟后期，SPSⅢ基因達到較高的表達水平，以利于甘蔗糖分積累進入成熟收獲期。

3 結論與討論

SPS已經被確認是甘蔗蔗糖積累過程中的主要關鍵酶之一，SPS活性可直接影響甘蔗的蔗糖合成能力和糖分積累[1-6，20]。SPS基因家族的不同成員在不同植物體內的表達特性不同，所發揮的功能也不同[21]。由于生產上的甘蔗品種多為異源多倍體，遺傳背景復雜且差異很大，加上甘蔗SPS基因家族又十分復雜，由此推斷，甘蔗SPS基因的表達情況也是十分復雜的。Gpl等研究發現，甘蔗SPS基因中的 B(Ⅴ) 和C(Ⅰ)家族主要在葉片中表達，D家族中的2個亞家族[D(Ⅲ)和D(Ⅳ)]在各種部位中均表現出較相似的表達水平[22]；而A(Ⅱ)家族在葉中表達量最低，從莖尖分生組織往下到第7節間的表達量表現為逐漸降低，而從甘蔗頂部葉到下部莖表達量逐節增強，在蔗莖中的轉錄量占SPS轉錄總量的40%。葉冰瑩等研究表明，在糖分積累初期蔗莖中的SPSⅡ相對表達量最大，在糖分積累中期蔗葉中的SPSⅡ相對表達量達到最高峰[23]；同組織部位中，糖分積累初期SPSⅡ 相對表達量高于糖分積累中、后期。Verma等用半定量PCR對甘蔗SPSⅡ的表達進行研究，結果表明，甘蔗SPSⅡ 基因在成熟節間比未成熟節間表達量高，高糖品種比低糖品種表達量高[24]。

關于SPSⅢ在甘蔗中的表達情況仍鮮有報道，本研究結果表明，SPSⅢ在GT28、果蔗Badila、ROC20、ROC22這4個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中均有表達，其表達量因基因型不同及測定部位與時期不同而異。其中，在工藝成熟初期，4個甘蔗基因型中，以GT28的4個部位較其他3個品種的低，而在果蔗Badila的4個部位中表達較穩定，在ROC20中以嫩葉鞘中表達量最高；而ROC22以在幼莖中表達量最高。在工藝成熟中期，SPSⅢ在4個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的表達量較初期沒有明顯差異；以在果蔗Badila 4個部位中的表達量稍高于其他3個品種，而在GT28的4個部位中表達量最低；在ROC20與ROC22的4個部位中表達量變化一致，以+1葉、嫩葉鞘中表達量明顯高于0葉和幼莖，尤其是在嫩葉鞘中。在工藝成熟后期，SPSⅢ在4個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的表達量較前2個時期迅速提高，均達到了較高的表達水平，尤其是在GT28、果蔗Badila和ROC20中，而在ROC22的0葉和嫩葉鞘2個部位中表達量較低。這表明，在甘蔗工藝成熟后期，SPSⅢ 達到較高的表達水平，利于甘蔗糖分積累，利于進入成熟收獲期。在本研究的4個甘蔗材料中，GT28、ROC20、ROC22都是生產上的甘蔗品種，遺傳背景差異很大。而果蔗Badila是甘蔗屬中的熱帶種典型代表之一，遺傳背景較單一[25]。因此，SPSⅢ在這4種不同基因型中的表達差異可能與甘蔗材料的遺傳背景有關?；虮磉_是SPS活性調控的主要方式之一[3]，因此，為了進一步探討SPS基因表達與甘蔗糖分積累的關系，對SPS基因家族中各成員的表達情況進行深入研究是十分必要的。至于SPSⅢ在高、低糖甘蔗基因型及不同成熟度節間的表達情況等還有待于繼續研究，以進一步探討SPSⅢ基因表達對甘蔗糖分積累的影響。

SPSⅢ在GT28、果蔗Badila、ROC20、ROC22這4個甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中均有表達，其表達量因基因型不同及測定部位與時期不同而異。在甘蔗工藝成熟后期，SPSⅢ達到較高的表達水平，利于甘蔗糖分積累，以利于甘蔗進入成熟收獲期，表明該基因很有可能在甘蔗的蔗糖代謝過程中發揮著重要作用。

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