沙地云杉、沙冬青和山杏ISSR-PCR反應體系優化及種間多態性比較

鄭舒文， 洪曉松， 王 昊

(遼寧省鹽堿地利用研究所，遼寧盤錦 124000)

沙冬青、山杏和沙地云杉都是內蒙古地區的特有植物。沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]屬于豆科蝶形花亞科沙冬青屬，是古老的殘遺瀕危物種，為常綠灌木，主要分布在我國西北地區，是中國北方干旱半荒漠地區唯一的旱生常綠闊葉灌木[1-2]，具有水土保持、固沙、觀賞和藥用價值[3]。沙地云杉(Piceamongolica)是中國稀有珍貴樹種，集中成片分布在生態環境惡劣的內蒙古自治區以克什克騰旗的白音敖包自然保護區，具有耐旱抗寒、防風阻沙、調節氣候等特點[4]。山杏(SiberianApricot)又名西伯利亞杏，為薔薇科杏屬植物，主要分布在俄羅斯的西伯利亞、蒙古的東部和東南部以及我國北緯40°地區，抗低溫能力強，根系發達，抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿，不耐澇。

內蒙古屬典型的中溫帶季風氣候，具有降水量少而不勻、寒暑變化劇烈的顯著特點[5]。這些生存并且繁衍的植物為了適應惡劣的環境，生理性狀發生改變的同時遺傳因子肯定也會發生一系列的變化。因此本研究通過4種特有物種的遺傳多樣性的分析，為種間雜交育種提供理論基礎，實現內蒙古特有植物的繁衍，進而為美化內蒙古的環境作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

摘取沙冬青、山杏、沙地云杉的種子，分裝放在布袋里，放在4 ℃冰箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 取各自的種子，去掉種皮，利用CTAB法提取基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測純度和濃度，UVP型凝膠成像分析系統拍照記錄，最后分別裝入1.5 mL離心管并保存在-20 ℃的條件下。

1.2.2 PCR擴增 ISSR-PCR反應體系經過優化確定為 20 μL，其中引物1 μL、TaqMix 10 μL、水8 μL、50 ng的模板 1 μL。引物序列由加拿大哥倫比亞大學提供，在上海生工生物技術有限公司合成。PCR擴增程序：94 ℃預變性 4 min；94 ℃ 變性 45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環；最后72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存。配制1.2%的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE的緩沖液中電泳45 min左右，取出凝膠，在UVP凝膠成像系統中拍照保存。

1.2.3 數據處理 記錄電泳圖譜中明亮清晰譜帶，建立“0-1”二元數據矩陣，在同一位置上，有譜帶的記作 “1”，沒有譜帶的記作“0”。利用POPGEN32軟件，得出觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣度(He)和Shannon多態性信息指數(I)。通過NTsys2.10e軟件，計算各供試材料間的相似性系數，采用UPGMA方法進行聚類分析，獲得聚類分析樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 4種植物DNA的檢測

基因組DNA質量的好壞是后續試驗的保證。本試驗直接用種子和改良的CTAB法提取4種植物的基因組DNA，如圖1可直接觀察到所提取的DNA條帶清晰明亮，并基本在同一水平位置上。說明基因組DNA完整性好，沒有降解現象。DNA模板的質量已經滿足試驗要求，可用于下一步的ISSR-PCR反應。

2.2 引物篩選和ISSR擴增分析

利用優化的反應體系從100個ISSR引物中篩選出11個穩定性好的引物進行分析，如表1所示，11個引物對沙冬青、沙地云杉、克旗山杏、涼城山杏這4種植物共擴增出187條譜帶，其中多態性DNA譜帶184，多態性條帶比例的平均值是98.40%。擴增條帶大多在500～2 000 bp之間。每個引物擴增出7～12條不等的條帶，擴增條帶數的平均值為9.5條，多態性條帶的均值為9，多態性百分率高達99.9%。從圖1和圖2都可以看出，同一個引物下，4種植物擴增出的譜帶不同，但是可以從譜帶的位置清晰地看出4種植物遺傳多樣性的差異很顯著。

表1 11條ISSR引物序列及其PCR擴增

2.3 4種植物的遺傳多樣性分析

觀測等位基因(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s 基因多樣度(He)與Shannon’s 信息指數(I)是度量遺傳多樣性水平的常用指標，運用 POPGENE32對4個種進行分析。4種植物在DNA水平上的PPL達到98.40%(表1)，由于它們是不同物種，所以多態性條帶較多是正常現象。4種植物的觀測等位基因數為1.984 0，有效等位基因數為1.678 1。其中有效等位基因數的數值越接近所檢測到的觀測等位基因數的絕對數，表明等位基因在群體中分布越均勻，因為有效等位基因數是反映群體遺傳變異大小的一個指標[14]。分析結果表明，它們相差0.305 9，差值相對較小，等位基因在群體中分布均勻，表明4種植物除了2個山杏物種遺傳多樣性相近以外，4種植物可能因為生長的環境相似，遺傳多樣性也有相對于其他植物沒有的共通點。另外，4種植物的基因多樣性指標He(0.396 4)和I(0.582 0)的值相對較小，遺傳多樣性相對較近，進一步說明它們之間的相似性。

2.4 遺傳距離和相似性的聚類分析

通過PopGen32計算Nei’s遺傳距離，分析4種植物的遺傳關系，4種植物的遺傳距離分布在0.401 1～0.913 6之間(表2)。其中沙冬青與涼城山杏遺傳距離為0.913 6，距離最大；克旗山杏和涼城山杏的遺傳距離是0.486 2，距離最小。遺傳距離是評價種間遺傳變異水平的重要指標，遺傳距離越小，親緣關系越近；遺傳距離越大，親緣關系越遠。由于克旗山杏和涼城山杏這2個植物是相同屬種，親緣性相關遺傳距離相對較近。但是克旗山杏和沙地云杉的遺傳距離為 0.653 8，相對其他2個植物的遺傳距離而言較小，說明它們之間存在一定的相似性。利用UPGMA法構建的聚類圖見圖4。由圖4可知，在0.64的區分度下，克旗山杏和涼城山杏聚為一類，沙冬青和沙地云杉各自一類。在0.45的區分度下，沙地云杉和山杏聚為一類。在0.43的區分度下，沙冬青跟山杏和沙地云杉聚成一類。表明沙地云杉與山杏有一定的相似性，4種植物的遺傳一致度、遺傳距離和聚類分析結果一致。

表2 物種種間遺傳一致度和遺傳距離

注：上三角為遺傳一致度，下三角為遺傳距離；1～4分別是沙冬青、克旗山杏、涼城山杏、沙地云杉。

3 結論與討論

采用分子標記探討植物的相似性已有較多的報道[6-8]。 目前，分子標記已廣泛應用于植物物種鑒定、指紋圖譜、遺傳多樣性、基因定位及分子生態學研究。本研究從100個ISSR引物中篩選出11個擴增條帶清晰且多態性高的引物，采用這11個引物對沙地云杉、沙冬青、克旗山杏和涼城山杏進行遺傳多樣性研究。應用POPGENE32分析和UPGAM法聚類分析，結果表明：沙地云杉、沙冬青、克旗山杏和涼城山杏可分為3類，首先克旗山杏和涼城山杏為Ⅰ類，沙地云杉為Ⅱ類，沙冬青為Ⅲ類。通過聚類分析結果顯示，除了山杏物種之間的親緣性之外，沙冬青與它們的遺傳距離大，相似性較低；沙地云杉與山杏2個不同物種卻有一定的相似性，遺傳距離小。

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