沙地云杉、沙冬青和山杏ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及種間多態(tài)性比較

鄭舒文， 洪曉松， 王 昊

(遼寧省鹽堿地利用研究所，遼寧盤錦 124000)

沙冬青、山杏和沙地云杉都是內(nèi)蒙古地區(qū)的特有植物。沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.]屬于豆科蝶形花亞科沙冬青屬，是古老的殘遺瀕危物種，為常綠灌木，主要分布在我國西北地區(qū)，是中國北方干旱半荒漠地區(qū)唯一的旱生常綠闊葉灌木[1-2]，具有水土保持、固沙、觀賞和藥用價(jià)值[3]。沙地云杉(Piceamongolica)是中國稀有珍貴樹種，集中成片分布在生態(tài)環(huán)境惡劣的內(nèi)蒙古自治區(qū)以克什克騰旗的白音敖包自然保護(hù)區(qū)，具有耐旱抗寒、防風(fēng)阻沙、調(diào)節(jié)氣候等特點(diǎn)[4]。山杏(SiberianApricot)又名西伯利亞杏，為薔薇科杏屬植物，主要分布在俄羅斯的西伯利亞、蒙古的東部和東南部以及我國北緯40°地區(qū)，抗低溫能力強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿，不耐澇。

內(nèi)蒙古屬典型的中溫帶季風(fēng)氣候，具有降水量少而不勻、寒暑變化劇烈的顯著特點(diǎn)[5]。這些生存并且繁衍的植物為了適應(yīng)惡劣的環(huán)境，生理性狀發(fā)生改變的同時(shí)遺傳因子肯定也會(huì)發(fā)生一系列的變化。因此本研究通過4種特有物種的遺傳多樣性的分析，為種間雜交育種提供理論基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)內(nèi)蒙古特有植物的繁衍，進(jìn)而為美化內(nèi)蒙古的環(huán)境作出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

摘取沙冬青、山杏、沙地云杉的種子，分裝放在布袋里，放在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 取各自的種子，去掉種皮，利用CTAB法提取基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)純度和濃度，UVP型凝膠成像分析系統(tǒng)拍照記錄，最后分別裝入1.5 mL離心管并保存在-20 ℃的條件下。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 ISSR-PCR反應(yīng)體系經(jīng)過優(yōu)化確定為 20 μL，其中引物1 μL、TaqMix 10 μL、水8 μL、50 ng的模板 1 μL。引物序列由加拿大哥倫比亞大學(xué)提供，在上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃ 變性 45 s，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存。配制1.2%的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE的緩沖液中電泳45 min左右，取出凝膠，在UVP凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 記錄電泳圖譜中明亮清晰譜帶，建立“0-1”二元數(shù)據(jù)矩陣，在同一位置上，有譜帶的記作 “1”，沒有譜帶的記作“0”。利用POPGEN32軟件，得出觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣度(He)和Shannon多態(tài)性信息指數(shù)(I)。通過NTsys2.10e軟件，計(jì)算各供試材料間的相似性系數(shù)，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，獲得聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種植物DNA的檢測(cè)

基因組DNA質(zhì)量的好壞是后續(xù)試驗(yàn)的保證。本試驗(yàn)直接用種子和改良的CTAB法提取4種植物的基因組DNA，如圖1可直接觀察到所提取的DNA條帶清晰明亮，并基本在同一水平位置上。說明基因組DNA完整性好，沒有降解現(xiàn)象。DNA模板的質(zhì)量已經(jīng)滿足試驗(yàn)要求，可用于下一步的ISSR-PCR反應(yīng)。

2.2 引物篩選和ISSR擴(kuò)增分析

利用優(yōu)化的反應(yīng)體系從100個(gè)ISSR引物中篩選出11個(gè)穩(wěn)定性好的引物進(jìn)行分析，如表1所示，11個(gè)引物對(duì)沙冬青、沙地云杉、克旗山杏、涼城山杏這4種植物共擴(kuò)增出187條譜帶，其中多態(tài)性DNA譜帶184，多態(tài)性條帶比例的平均值是98.40%。擴(kuò)增條帶大多在500～2 000 bp之間。每個(gè)引物擴(kuò)增出7～12條不等的條帶，擴(kuò)增條帶數(shù)的平均值為9.5條，多態(tài)性條帶的均值為9，多態(tài)性百分率高達(dá)99.9%。從圖1和圖2都可以看出，同一個(gè)引物下，4種植物擴(kuò)增出的譜帶不同，但是可以從譜帶的位置清晰地看出4種植物遺傳多樣性的差異很顯著。

表1 11條ISSR引物序列及其PCR擴(kuò)增

2.3 4種植物的遺傳多樣性分析

觀測(cè)等位基因(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s 基因多樣度(He)與Shannon’s 信息指數(shù)(I)是度量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)，運(yùn)用 POPGENE32對(duì)4個(gè)種進(jìn)行分析。4種植物在DNA水平上的PPL達(dá)到98.40%(表1)，由于它們是不同物種，所以多態(tài)性條帶較多是正常現(xiàn)象。4種植物的觀測(cè)等位基因數(shù)為1.984 0，有效等位基因數(shù)為1.678 1。其中有效等位基因數(shù)的數(shù)值越接近所檢測(cè)到的觀測(cè)等位基因數(shù)的絕對(duì)數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻，因?yàn)橛行У任换驍?shù)是反映群體遺傳變異大小的一個(gè)指標(biāo)[14]。分析結(jié)果表明，它們相差0.305 9，差值相對(duì)較小，等位基因在群體中分布均勻，表明4種植物除了2個(gè)山杏物種遺傳多樣性相近以外，4種植物可能因?yàn)樯L的環(huán)境相似，遺傳多樣性也有相對(duì)于其他植物沒有的共通點(diǎn)。另外，4種植物的基因多樣性指標(biāo)He(0.396 4)和I(0.582 0)的值相對(duì)較小，遺傳多樣性相對(duì)較近，進(jìn)一步說明它們之間的相似性。

2.4 遺傳距離和相似性的聚類分析

通過PopGen32計(jì)算Nei’s遺傳距離，分析4種植物的遺傳關(guān)系，4種植物的遺傳距離分布在0.401 1～0.913 6之間(表2)。其中沙冬青與涼城山杏遺傳距離為0.913 6，距離最大；克旗山杏和涼城山杏的遺傳距離是0.486 2，距離最小。遺傳距離是評(píng)價(jià)種間遺傳變異水平的重要指標(biāo)，遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近；遺傳距離越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。由于克旗山杏和涼城山杏這2個(gè)植物是相同屬種，親緣性相關(guān)遺傳距離相對(duì)較近。但是克旗山杏和沙地云杉的遺傳距離為 0.653 8，相對(duì)其他2個(gè)植物的遺傳距離而言較小，說明它們之間存在一定的相似性。利用UPGMA法構(gòu)建的聚類圖見圖4。由圖4可知，在0.64的區(qū)分度下，克旗山杏和涼城山杏聚為一類，沙冬青和沙地云杉各自一類。在0.45的區(qū)分度下，沙地云杉和山杏聚為一類。在0.43的區(qū)分度下，沙冬青跟山杏和沙地云杉聚成一類。表明沙地云杉與山杏有一定的相似性，4種植物的遺傳一致度、遺傳距離和聚類分析結(jié)果一致。

表2 物種種間遺傳一致度和遺傳距離

注：上三角為遺傳一致度，下三角為遺傳距離；1～4分別是沙冬青、克旗山杏、涼城山杏、沙地云杉。

3 結(jié)論與討論

采用分子標(biāo)記探討植物的相似性已有較多的報(bào)道[6-8]。 目前，分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物物種鑒定、指紋圖譜、遺傳多樣性、基因定位及分子生態(tài)學(xué)研究。本研究從100個(gè)ISSR引物中篩選出11個(gè)擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性高的引物，采用這11個(gè)引物對(duì)沙地云杉、沙冬青、克旗山杏和涼城山杏進(jìn)行遺傳多樣性研究。應(yīng)用POPGENE32分析和UPGAM法聚類分析，結(jié)果表明：沙地云杉、沙冬青、克旗山杏和涼城山杏可分為3類，首先克旗山杏和涼城山杏為Ⅰ類，沙地云杉為Ⅱ類，沙冬青為Ⅲ類。通過聚類分析結(jié)果顯示，除了山杏物種之間的親緣性之外，沙冬青與它們的遺傳距離大，相似性較低；沙地云杉與山杏2個(gè)不同物種卻有一定的相似性，遺傳距離小。

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