抗枇杷根腐病病菌的枇杷內生木霉P3.9菌株生物學特性

魯海菊， 張曉永， 江 濤， 胡金碧， 田學軍

(紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自 661199)

隨著農業產業結構調整，大規模連片種植單一作物導致土壤連作障礙日漸突顯，土傳病害是導致土壤連作障礙的重要因素之一，而引入拮抗菌是生物防治連作障礙的措施之一[1]。木霉(Trichoderma)是防治作物土傳病害的重要拮抗真菌，曾成功防治辣椒白絹病和猝倒病[2]、黃瓜枯萎病[3]、辣椒疫病[4]等多種土傳病害。雖然野生型木霉菌株對植物病原菌有較強的抑制作用，但在田間其防效會大幅度下降，其主要原因是木霉在根際土壤中定殖受到各種環境因素的影響，很難成功定殖。有學者曾用紫外線誘變方法獲得強根際能力的木霉菌株[5]。眾多學者研究表明，在植物體內存在內生木霉，在可可[6]、茶樹[7]、蘆竹[8]、南方紅豆杉[9]等植物中成功分離到內生木霉。其中，在蘆竹和南方紅豆杉中分離的木霉分別對煙草赤星病和水稻紋枯病有很好的防治效果。同時發現，從其他地方分離的木霉菌株也能在可可莖上定殖，與其形成共生關系，最終成為宿主的內生真菌[10]。說明不管是本地的內生木霉還是從外界引入的木霉，均能與宿主形成共生關系，最終成為宿主的內生真菌，對宿主有促生、抗病等作用[11]。內生木霉受到寄主植物的良好保護，并能獲得足夠的碳、氮源供其自身生長。因此，內生木霉比其他腐生的木霉更易于發揮生防作用。筆者從枇杷主干韌皮部中分離到1株內生木霉P3.9菌株，它對枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsissp.)[12]、康乃馨根腐病病菌(Fusariumsp.)[12]、辣椒黃萎病病菌(Verticilliumsp.)[12]、萬壽菊葉斑病病菌(Alternariasp.)[12]、石榴干腐病病菌[13]等均具有強烈的抑制作用，能成功定殖于枇杷主干及黃瓜根、莖、葉中，并具有固氮、抗化學農藥、降解難溶性磷酸鹽、降解纖維素等多種功能[14]?？梢?，內生木霉P3.9菌株具有廣闊的開發應用前景。因此，對枇杷內生木霉P3.9菌株進行生物學特性研究，可為進一步開發其應用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 筆者從枇杷主干韌皮部組織分離內生真菌，經枇杷根腐病菌對峙培養篩選，獲得抗枇杷根腐病病菌的木霉P3.9菌株(Trichodermasp.)。

1.1.2 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，簡稱PDA；配方為200 g馬鈴薯、16 g葡萄糖、20 g 瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(potato saccharose agar，簡稱PSA；配方為200 g馬鈴薯、16 g蔗糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL 蒸餾水)、玉米瓊脂培養基(maize agar，簡稱MA；配方為30 g 玉米、17 g瓊脂粉、1 000 mL 蒸餾水)、小麥瓊脂培養基(wheat agar，簡稱WA；配方為30 g小麥、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、枇杷瓊脂培養基(loquat agar，簡稱LA；配方為200 g枇杷葉、20 g 瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、胡蘿卜瓊脂培養基(carrot agar，簡稱CA；配方為200 g胡蘿卜、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)、查貝氏(Czapek’s)培養基(配方為2.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸二氫鉀、0.50 g氯化鉀、0.50 g七水硫酸鎂、0.01 g硫酸鐵、30.00 g 蔗糖、20.00 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水)。

1.1.3 試驗試劑 碳源(葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、蔗糖、D-甘露醇)、氮源(酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨)。上述材料均購自當地農貿市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同培養基對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 將內生木霉P3.9菌株接種在PDA平板培養基中，28 ℃條件下擴大培養5 d，在培養基同一半徑周圍用打孔器取直徑為 5 mm 的菌絲塊，同時接種于PDA、PSA、MA、WA、CA、LA等6種培養基平板中央，設3次重復，在28 ℃條件下恒溫培養，5 d 后采用十字交叉法[15]測定其菌落直徑。

1.2.2 碳、氮源對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以查貝氏培養基為基礎培養基，分別用相同質量分數的碳(葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、蔗糖、D-甘露醇)和氮(酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨)替換蔗糖和硝酸鈉，菌株接種以及菌落直徑測量同“1.2.1”節中的方法。

1.2.3 溫度對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以PDA為供試培養基，接種后分別在溫度為5、10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下恒溫培養，菌株接種及菌落直徑測量同“1.2.1”節中的方法。

1.2.4 pH值對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以PDA為供試培養基，分別用0.1%鹽酸、0.1%氫氧化鈉將pH值調至3、4、5、6、7、8、9、10，菌株接種以及菌落直徑測量同“1.2.1”節中的方法。

1.2.5 光照對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以PDA為供試培養基，接種后分別在光—暗交替(12 h—12 h)、全黑暗和全光照3種光處理下培養，菌株接種以及菌落直徑測量同“1.2.1”節中的方法。

1.2.6 不同濕度對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響 以PDA為供試培養基，接種后分別在50%、60%、70%、80%、90%、100%濕度條件下，28 ℃恒溫條件下黑暗培養5 d，菌株接種以及菌落直徑測量同“1.2.1”節中的方法。

1.2.7 不同營養液對內生木霉P3.9孢子萌發的影響 用2%葡萄糖、2%蔗糖、2%蛋白胨、2%葡萄糖+1%蛋白胨、2%蔗糖+1%蛋白胨配制1×106個/mL P3.9菌株木霉孢子液，取0.2 mL涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫條件下黑暗培養 18 h 后觀察。

1.2.8 內生木霉P3.9菌株孢子的致死溫度 用無菌水配制1×106個/mL木霉P3.9菌株孢子液，放入離心管中，在溫度為40、45、50、52、55 ℃條件下水浴10 min，在28 ℃恒溫條件下黑暗培養18 h后觀察孢子的萌發情況。以上所有配制好的培養基用高壓蒸汽滅菌鍋于121 ℃條件下滅菌25 min。

1.2.9 數據統計 所有試驗數據均采用SPSS 19.0統計軟件中的Duncan’s多重比較法進行統計分析，計算處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表1可知，內生木霉P3.9菌株在不同培養基上均能正常生長，具有較強的營養適應性。內生木霉P3.9菌株在PDA培養基上生長的菌落直徑與在其他培養基上生長的菌落直徑相比差異極顯著，菌落直徑最大，說明PDA培養基最適合內生木霉P3.9菌株菌絲生長。

表1 不同培養基對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

注：同列數據后不同大寫、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著，下表同。

2.2 不同碳源對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表2可知，內生木霉P3.9菌株在不同碳源培養基上均能正常生長，具有較強的碳源適應性。相比較而言，蔗糖中的菌絲生長菌落直徑與其他碳源差異極顯著，菌落直徑最小(除無碳源對照外)，說明蔗糖不適合內生木霉P3.9菌株菌絲生長，而其他6種供試碳源均適合其菌絲生長。由圖1可知，D-果糖產孢量最多，因此D-果糖最適合內生木霉P3.9菌株產孢。

表2 不同碳源對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.3 不同氮源對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表3可知，內生木霉P3.9菌株在不同氮源培養基上均能正常生長，具有較強的氮源適應性。在磷酸二氫銨中生長的內生木霉P3.9菌株菌落直徑與其他6種供試氮源相比，差異極顯著，菌落直徑最大，說明磷酸二氫銨最適合內生木霉P3.9菌株菌絲生長。另外觀察可知，銨態氮適合內生木霉P3.9菌株產孢(圖2)。

表3 不同氮源對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.4 不同溫度對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表4可知，在溫度為10～35 ℃之間，內生木霉P3.9菌株菌絲均能正常生長，在15～30 ℃之間內生木霉P3.9菌株菌落直徑分別與其他溫度處理差異極顯著，菌落直徑較大，說明在15～30 ℃范圍內最適合內生木霉P3.9菌株菌絲生長。由圖3可知，與溫度為25、30 ℃處理相比，在28 ℃條件下內生木霉P3.9菌株產孢量較多，適合產孢。

表4 不同溫度對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.5 不同pH值對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表5可知，在pH值為3～10時，內生木霉P3.9菌株菌絲均能正常生長，菌落直徑差異不顯著，均達到90.0 mm，具有較強的pH值適應性。由圖4可以看出，pH值為10時，內生木霉P3.9菌株菌絲直徑最大，產孢量最多。

表5 不同pH值對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.6 光照對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表6可知，在光暗交替(12 h—12 h)、全黑暗和全光照3種光處理下，內生木霉P3.9菌株菌落直徑差異不顯著，菌落直徑均達到90.0 mm，說明光照并不影響菌絲生長。其中，光暗交替最適合其產孢(圖5)。

表6 光照對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.7 不同濕度對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

由表7可知，在不同濕度下內生木霉P3.9菌株菌落直徑差異不顯著，菌落直徑均達到90.0 mm，說明濕度不影響內生木霉P3.9菌株菌絲生長。

表7 不同濕度對內生木霉P3.9菌株菌絲生長的影響

2.8 不同營養液對內生木霉P3.9菌株孢子萌發的影響

由表8可知，與清水對照相比，不同配比的葡萄糖、蔗糖和蛋白胨溶液對內生木霉P3.9菌株孢子萌發率影響差異極顯著，說明內生木霉P3.9菌株孢子萌發受葡萄糖、蔗糖和蛋白胨溶液的影響，其中2%蛋白胨溶液極顯著促進內生木霉P3.9菌株孢子萌發，2%葡萄糖和2%蔗糖溶液則極顯著抑制孢子萌發。

表8 不同營養液對內生木霉P3.9菌株孢子萌發的影響

2.9 內生木霉P3.9菌株孢子致死溫度

由表9可知，在28 ℃恒溫條件下培養18 h，不同溫度水浴處理的內生木霉P3.9菌株孢子萌發率差異明顯，在52、55 ℃ 2種處理中，內生木霉P3.9菌株孢子的萌發率為0，兩者間無顯著差異，因此選擇52 ℃作為內生木霉P3.9菌株孢子的致死溫度(圖6)。

表9 內生木霉P3.9菌株孢子致死溫度

3 結論與討論

生物學測定結果表明，枇杷內生木霉P3.9菌株最適合的培養條件為PDA培養基、碳源為D-果糖、氮源為磷酸二氫銨、溫度為28 ℃、pH值=10、光暗交替；2%蛋白胨溶液能極顯著提高內生木霉P3.9菌株孢子萌發率，孢子致死溫度為 52 ℃，銨態氮適合產孢。D-果糖、葡萄糖、麥芽糖、α-乳糖和D-甘露醇5種碳源之間對內生木霉P3.9菌株菌絲生長差異不顯著，但D-果糖產孢量最多，因此D-果糖為最適合碳源；在15～30 ℃范圍內，內生木霉P3.9菌株菌絲均可以獲得正常生長，但28 ℃適合產孢，因此產孢最佳溫度為 28 ℃；pH值在3～10范圍內，內生木霉P3.9菌株菌絲均可以正常生長，但pH值=10適合產孢，因此pH值=10為最佳酸堿度；光照不影響菌絲生長，但能促進產孢，光暗交替產孢量最大，因此光暗交替最適合P3.9木霉菌株生長。

在楊樹枝干上分離的T88木霉菌株最佳培養條件為PDA培養基、碳源為果糖、溫度為30 ℃，光照有利于產孢[16]，銨是木霉菌最易利用的氮源[17]，與本研究結論基本一致。分離自菜園土中的綠色木霉HT-01菌株的最佳酸堿度為5[18]，與本研究結論不一致，導致該差異的原因可能是2個菌株之間小生境不一致，枇杷屬于堿性果樹，在其中生長的木霉菌株長期適應堿性環境，因此偏堿性更適合其生長。這也是內生菌與寄主相互適應、協調進化[19]的又一個例證。1%葡萄糖溶液促進木霉菌Tr 970菌株孢子萌發，致死溫度為55 ℃(15 min)[20]，與本研究結論不一致。在15～40 ℃范圍內長枝木霉TICC菌株能生長產孢，在35 ℃時菌絲生長最快[21]，與本研究結論不一致。說明不同木霉菌株生長溫度范圍變化幅度較大，內生木霉P3.9菌株生長溫度范圍為15～30 ℃，在溫度為10、35 ℃條件下菌絲雖能生長，但速度很慢，由此推測內生木霉P3.9菌株只適合應用在晝夜溫差及季節溫差不大的南方。

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