PP333處理對休眠期山藥珠芽內源激素的影響

魏靈敏， 段延碧， 龍雯虹， 張雪梅， 孟金貴

(1.云南農業大學園林園藝學院，云南昆明 650201； 2.云南農業大學農科實驗教學示范中心，云南昆明 650201； 3.云南農業大學農學與生物技術學院，云南昆明 650201)

山藥(Dioscoreaopposita)是我國大眾化菜藥兼用的滋補食品，藥用價值高，有健脾、固精、補肺、益腎的功能[1]。生產上用莖段進行繁殖，繁殖系數低，生產成本高。趙冰等對山藥栽培特性進行觀測，發現只有用珠芽對山藥進行更新復壯，才可解決山藥長期栽培后出現種性退化的問題，但珠芽發芽需數月之久，影響生產上的適時播種[2]。

通常認為，休眠由內源激素控制，休眠的起始、終止和調控以及休眠階段的各層次變化均受激素調節[3]。前人對山藥珠芽的激素調控進行了一定的研究，龍雯虹等探索出用多效唑針刺珠芽中部可促進珠芽發芽，并用不同濃度的多效唑和矮壯素水溶液處理不同休眠期的山藥珠芽，證明了1～10 mg/L 多效唑水培能顯著打破采后60 d的珠芽休眠[4]；在此基礎上，王軍民等用多效唑和氯吡脲配施對山藥珠芽及中后期長勢的影響進行了相關研究[5]；苗麗娟等發現2%和5%的雙氧水促進收獲后60 d的珠芽提早出芽[6]；另外，龍雯虹等分別測定了不同生長階段的山藥珠芽內源激素IAA、ZR、DHZR、GA3和ABA的含量，探討了GA3/ABA的比值變化，發現生長期ZR的含量變化大，且GA3含量較高[7]，并對珠芽休眠期內源激素含量做了相關研究，證明珠芽發芽需要GA3含量降低和ZR含量升高，PP333使GA3含量下降速度加快，縮短了珠芽的休眠期[8]。

前人用10 mg/L的PP333處理珠芽后對內源激素GA3的含量進行了測定[8]，但仍不能解釋PP333等生長抑制劑對休眠期珠芽效應不同的現象。同時，珠芽的休眠是由萌發抑制物和生長促進物間的平衡所決定，為此該研究測定了不同濃度PP333處理后休眠期珠芽的赤霉素(GA3)、細胞分裂素異戊烯基腺苷(iPA)、玉米素核苷(ZR)和二氫玉米素核苷(DHZR)含量變化，并對激素間的平衡關系進行了探討，旨在探索出休眠期珠芽內源激素的變化規律及對多效唑的響應，為將來研究對珠芽進行外源激素的調控打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛尾山藥種苗來源于云南省祿豐縣，選取當年無病蟲害、飽滿的山藥珠芽為試驗材料。

1.2 PP333處理山藥珠芽

將收獲后放于室內60 d的珠芽用多菌靈500倍液浸泡10 min后用清水洗凈，擦干珠芽表面水分，用5、25、45、65、85 mg/L PP333溶液浸泡珠芽24 h后，取出珠芽裝于培養皿，用濕潤蛭石培養。以蒸餾水處理作對照，每處理100粒珠芽，重復3次。每隔7 d隨機各取5粒珠芽，切碎混勻后置入液氮中冷凍15 min后，放入-20 ℃冰箱以備測定內源激素iPA、ZR、DHZR、GA3的含量，取樣直到珠芽發芽為止。

1.3 內源激素含量測定

激素的提取方法：稱取樣品0.5～1.0 g，在弱光和冰浴條件下，加入2 mL 80%甲醇提取液(含1 mmol/L二叔丁基對甲苯酚)研磨成漿，轉入離心管中，再用3 mL提取液洗研缽3次，4 ℃提取4 h，其間手動搖離心管數次；4 h后4 ℃下 3 500 r/min、離心8 min，取上清液轉入10 mL定容瓶中，剩下殘渣用3 mL提取液4 ℃下提取1 h，離心后取上清液轉入 10 mL 定容瓶中，將剩下殘渣用2 mL提取液提取、離心，合并所有上清液，定容至10 mL，即得激素提取液。

激素的測定方法：取1 mL提取液-氮氣吹干-樣品稀釋液溶解-用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定激素，測定方法和試劑盒由中國農業大學化控中心提供。

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel軟件和SPSS軟件進行處理和分析。

式中：N為測定濃度；V2為提取液總體積；V3為定容稀釋液體積；B為稀釋倍數；V1為真空濃縮上清液體積；W為植物樣品鮮質量(g)。

2 結果與分析

2.1 休眠期至生長期內源激素含量變化

如圖1所示，GA3和ZR含量變化呈現“下降—上升—下降—上升”的趨勢，iPA和DHZR含量經歷了2個波峰后，最后均呈現出上升的趨勢。至培養7 d時，DHZR、ZR和iPA的含量均出現下降；在7～21 d時，ZR和GA3含量呈現急速的下降趨勢，iPA和DHZR含量則經歷了1個波峰，且在21 d時，iPA和DHZR含量與它們最開始的激素水平相持平；在休眠后期(21～35 d)，GA3含量隨著休眠的深入而不斷升高，DHZR、ZR和iPA的含量呈波動式上升；在萌芽期(35～42 d)，除iPA含量上升外，其他激素含量均下降到最低值；在生長期(42～56 d)，4種激素含量表現出明顯的上升趨勢，且在56 d均達到了峰值；ZR含量在整個休眠期至生長期始終遠高于DHZR、GA3和iPA的含量。

2.2 休眠期至生長期內源激素含量比值的動態變化

如圖2所示，在休眠期(0～35 d)，iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3比值呈現“下降—上升—下降”的趨勢；在萌芽期(35～42 d)，iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3比值均呈現上升的趨勢，其中iPA/GA3比值上升最為明顯，由此可知，培養35～42 d時GA3含量的下降，促使iPA/GA3、DHZR/GA3和ZR/GA3的比值回升，促進了休眠的解除。在生長期(42～56 d)，隨著GA3含量的快速上升，激素間的比值則快速下降。

在休眠期至生長期，GA3與iPA含量呈正相關，相關系數是0.574；ZR與GA3含量呈顯著正相關，相關系數是 0.894；ZR與iPA、iPA與DHZR、ZR與DHZR、GA3與DHZR含量均呈不相關，表明它們之間關系不緊密。

2.3 PP333處理后內源激素含量的動態變化

如圖3所示，DHZR含量在培養14 d達到高峰，但隨后迅速下降，在21～35dDHZR含量有較小的起伏；在35～42d時，85 mg/L PP333處理呈現大幅度的上升，且高于其他處理的含量，這一階段其他處理沒有明顯變化。方差分析表明，相同濃度的處理在不同時期珠芽DHZR含量差異極顯著(F=4.741，P=0.000<0.01)；同時期不同濃度處理間DHZR含量差異不顯著。

在PP333處理0～7 d，45～65 mg/L的PP333處理ZR含量呈現上升趨勢，其余處理則呈現下降趨勢；在休眠中期(7～21 d)，除85 mg/L PP333處理經歷了1個波峰外，這一階段其他處理則急速下降至最低值；在萌芽期(35～42 d)，45 mg/L PP333和85 mg/L PP333處理呈現大幅度的上升，這一階段其他處理表現為下降趨勢；在休眠破除時(42 d)，所有處理的含量均高于對照，說明PP333對ZR含量有一定的促進作用。方差分析表明，相同濃度的處理在不同時期珠芽的ZR含量差異極顯著(F=11.825，P=0.000<0.01)；同時期不同濃度處理間ZR含量差異不顯著。

經PP333處理過的珠芽iPA含量在休眠中期(7～21 d)表現為“低濃度促進、高濃度抑制”的趨勢；在萌芽期(35～42 d)，所有處理均呈現大幅度的上升。方差分析表明，同時期不同濃度處理間iPA含量差異不顯著；相同濃度處理在不同時期珠芽的iPA含量差異顯著(F=2.561，P=0.017<0.05)。

經5～65 mg/L PP333處理的珠芽GA3含量在0～21 d均表現下降趨勢，這可能是因為PP333的作用機理是抑制植物內部GA3的產生。在休眠后期(21～35 d)，5～65 mg/L PP333的處理均經歷了1個波峰，對照在這一階段持續上升；在萌芽期(35～42 d)，GA3保持低含量水平；在生長期(42～56 d)，全部處理GA3含量呈現快速的上升趨勢。方差分析表明，相同濃度的處理在不同時期珠芽的GA3含量差異極顯著(F=7.019，P=0.000<0.01)；同時期不同濃度處理間GA3含量差異不顯著。

2.4 PP333處理后內源激素間比值的動態變化

如圖4所示，各處理的激素比值變化趨勢基本一致，在培養0～21 d時，DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3的比值均出現大幅度上升；在休眠中期(21～35 d)，4種激素之間比值繼續下降，由于生長促進類激素iPA、DHZR含量下降到較低水平，GA3含量此時呈現緩慢上升的趨勢，使得DHZR/GA3、iPA/GA3比值基本小于1，此時ZR/GA3的比值呈現先下降后上升的趨勢，為珠芽的萌發做準備；在萌芽期(35～42 d)，GA3含量緩慢下降，使DHZR/GA3和iPA/GA3的比值有回升趨勢；在生長期(42～56 d)， DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3的比值均表現出不同程度的下降趨勢，這可能是生長期間GA3含量遠高于ZR、iPA、DHZR的含量而導致的結果。

珠芽激素(iPA+ZR+DHZR)/GA3的比值在休眠期至生長期經歷了2個波峰，在休眠期(0～28 d)，所有處理均呈上升趨勢，而在處理14～21 d 85 mg/L PP333處理(iPA+ZR+DHZR)/GA3比值低于其他處理的比值，在處理42 d時，85 mg/L PP333處理比值遠高于其他處理。由此可知，PP333在休眠期能促進細胞分裂素含量的增加，以85 mg/L PP333處理的效果最為明顯，其他濃度PP333處理的激素比值則與對照的比值差異不顯著。

3 結論與討論

3.1 內源激素與珠芽休眠萌發的關系

該試驗結果表明，iPA含量變化與山藥珠芽的發育過程相一致。休眠期iPA含量一直較低，原因可能是休眠的珠芽在聚集能量以抵御寒冷的氣候和為珠芽提供過冬的營養物質，又或者iPA可能并未直接參與休眠的解除。在生長期iPA含量急速上升，由此猜測iPA的作用在于珠芽解除休眠后的萌發生長。經初步分析，iPA含量增加是因為營養需求增加，反之亦然。

種子休眠的解除總是與赤霉素類物質的積累相伴發生[9]。未經PP333處理的珠芽GA3含量經歷先升再降最后升高的過程，在休眠期低溫促進了GA3的合成，促使GA3含量的持續升高，這與龍雯虹等的研究[10]一致，而經PP333處理的珠芽經歷了下降再升高的過程，即PP333抑制休眠期GA3的升高，而休眠解除時GA3含量達最低值，這一結果與前人研究GA3抑制珠芽發芽的結論[11-12]一致，至生長期GA3含量升高，可能是因為GA3需較高水平才有利于種子細胞分裂、伸長和種子發育所需的養分吸收[13]，因此GA3在珠芽的休眠期至生長期起著雙重作用，即先抑制萌發、后促進生長，有關這一現象的內在機理還需進一步探索。

ZR具有抵消萌發抑制物質、調控種子發育中的物質和能量代謝的作用[14]。本試驗結果表明，ZR含量隨著休眠程度的加深而增加，由此推測ZR在休眠期加快了細胞分裂分化的速度，加厚了珠芽的外皮，提高了對珠芽的保護能力。在休眠期DHZR、GA3和iPA含量上升的作用是促進細胞分裂，高含量的生長促進類激素ZR迅速降低減少了對GA3的制約，使GA3在珠芽的休眠中發揮主要作用。隨著休眠的解除，ZR含量快速上升，此時，細胞分裂素可能促進細胞分裂和擴大，誘導了珠芽的分化。因此，ZR能夠克服萌發抑制的因子，解除休眠，促進珠芽的萌發。

DHZR含量在休眠至萌發期較其他激素低，休眠期DHZR含量上升是為了聚集能量，休眠后期的緩慢下降可能是受到低溫和GA3共同抑制作用。

3.2 珠芽休眠期至萌發期內源激素間的平衡關系

由內源激素間比值變化可以看出，較低的DHZR/GA3、iPA/GA3和ZR/GA3比值有利于休眠。其中DHZR/GA3和iPA/GA3通過低比值減少對休眠的抑制，從而對休眠發揮間接的調控作用。ZR/GA3比值進入休眠期迅速下降，休眠后期又明顯回升，與休眠進程相一致，因此認為ZR與GA3間的平衡變化對休眠的調控起主要作用。

根據內源激素間的相關性分析，iPA與GA3、ZR與GA3的相關性較緊密，且iPA/GA3和ZR/GA3比值變化趨勢相同，說明GA3解除休眠作用與內源激素平衡有關，但內源激素之間具體的協同作用機理有待進一步研究。

3.3 PP333對珠芽內源激素的影響

本試驗發現，5～65 mg/L PP333處理的珠芽和對照同時萌發，在解除休眠期85 mg/L PP333處理的珠芽GA3含量最低，這一變化使處理比對照提前7 d發芽，這與龍雯虹等研究的PP333處理能加快珠芽休眠后期GA3含量下降的速度，使珠芽提前發芽的結論[8]相一致，也與王鵬等在馬鈴薯的休眠研究中認為GA3在調節萌發和解除休眠時起重要作用，抑制劑和細胞分裂素起輔助作用的結論[15]一致。同時，萌發期不一致或許是珠芽對不同濃度PP333處理的感應程度不同。

經PP333處理的珠芽ZR含量在萌芽期均高于對照，GA3含量在休眠期均低于對照，說明PP333有助于提高萌芽期ZR含量，降低休眠期GA3含量。通過內源激素間的比值關系，可以看出山藥珠芽的休眠進程取決于多種內源激素的平衡，而不是取決于單一激素的含量，所以筆者認為山藥珠芽促成栽培的研究不應僅僅局限于通過施用外源PP333解除珠芽休眠，而應充分利用其他植物激素，同時重視對外部環境因素綜合而深入的研究，尋求打破山藥珠芽休眠的有效方法，從而促進山藥的周年商業生產。

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