普通白菜石蠟切片染色方法篩選及花芽分化形態學鑒定

宋紅霞， 付 超， 侯雷平， 李梅蘭

(山西農業大學園藝學院，山西太谷 030801)

普通白菜(Brassicarapasubsp.chinensis)是典型的低溫長日照二年生蔬菜，需要經過一段時間低溫處理，通過春化，才可以在高溫長日照條件下現蕾開花，而花芽分化是現蕾開花的前提，也是普通白菜從營養生長向生殖生長轉變的形態標志[1]。詳細的分化過程是開花調控機制研究的理論基礎，同時對制定合理的栽培措施進行花期調控及實現分子遺傳調控也有重要意義[2]。

石蠟切片技術是組織學和生物學研究的主要方法，傳統石蠟切片的制作一般須經過脫水、透明、浸蠟、包埋、染色及封固等步驟[3]。在植物組織石蠟切片采用的染色方法中，染料的選擇、操作方法和染色時間等都是影響染色成敗的重要因素[4]。不少植物學研究者針對不同染色材料采用不同的染色方案和染色時間，探索了不同材料的最佳染色方法，如在粳稻穎果石蠟切片中對染色時間的摸索[5]，以及對韭菜、樺樹松蘿、水稻等染色方法的研究[6-8]。

關于普通白菜花芽分化的發生，李曙軒等已經進行過相關研究[9-10]，但對于石蠟制片方法沒有進行報道而且分化過程不夠詳盡。因此，本試驗以75#普通白菜為試驗材料，對石蠟切片制作過程中不同染色方法、染色時間進行比較，并對花芽分化過程進行詳細研究，以期為普通白菜的生殖發育研究提供理論支撐，也為白菜類蔬菜石蠟切片的染色方法提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

供試普通白菜75#為弱冬性自交系，由山西省農業科學院蔬菜研究所惠贈。

選取飽滿且較為整齊一致的種子，用清水漂洗后于55 ℃水浸泡10 min，室溫浸種2 h，然后置于鋪有雙層濾紙的培養皿中，置于25 ℃恒溫光照人工氣候室內催芽，光照時間 16 h/d。待胚根突破種皮后，將培養皿移至4 ℃冰箱，黑暗、低溫處理20 d，其間保證種子萌發需要的水分[11]，處理結束后將幼苗種植于50孔穴盤中，內含泥炭-蛭石基質混合物(3 ∶1)，在溫室進行常規栽培管理(白天最高溫度30 ℃，夜間最低溫度10 ℃，光照時間約11 h/d)。

1.2 方法

1.2.1 取樣 待7張真葉展開后，每隔2 d剝取莖尖，在體視顯微鏡(Olympus SZX16)下觀察發育時期，參照李曙軒等方法對不同花芽分化等級進行取樣[9，12]。

1.2.2 固定包埋 參照Garcês等的方法[13-14]將樣品進行包埋，之后放于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 切片 參照高行英的方法[15]，切片厚度為8 μm。

1.2.4 展片與粘片 以多聚賴氨酸(Sigma)為粘片劑，展片鍋的溫度為37 ℃恒溫，將切下的蠟片放在液面上，光面朝下，蠟片展平后，將處理好的載玻片伸入水中，撈起蠟片，放在干凈的工作臺上，晾干。

1.2.5 脫蠟 為了將組織中的蠟去除，按照以下步驟進行操作：二甲苯10 min→1/2二甲苯+1/2純乙醇10 min→純乙醇5 min→95%乙醇10 min→85%乙醇10 min→70%乙醇5 min，逐級脫蠟。

1.2.6 染色方法及時間篩選 番紅(AMRESCO)配方：1 g番紅，100 mL 50%乙醇，過濾。固綠(AMRESCO)配方：0.5 g固綠，100 mL 95%乙醇。

番紅染色步驟：番紅液xh→70%乙醇1 min→85%乙醇1 min→純乙醇2 min→二甲苯3 min→二甲苯3 min。先設置3個較大的時間梯度：2、12、24 h，再在合適的時間內設置相對較小的時間梯度：0.5、1、2、4、6、8 h，以確定番紅染色的最佳時間。

固綠染色步驟：固綠ys→純乙醇30 s→純乙醇2 min→二甲苯3 min→二甲苯3 min，染色時間：10、20、30 s。

番紅-固綠對染：番紅液xh→70%乙醇1 min→85%乙醇1 min→固綠ys→純乙醇30 s→純乙醇1 min→二甲苯 3 min→二甲苯3 min，番紅-固綠對染時間根據最佳時間進行搭配組合。

1.3 普通白菜花芽分化過程的觀察

應用“1.2”節中得到的最佳染色方法將普通白菜的頂端部位進行組織切片，以觀察主枝、側枝花芽分化，分析其形態發生過程。

2 結果與分析

2.1 番紅單獨染色切片效果

根據圖1的對比效果可以看出，染色12、24 h的組織較暗淡，而且染色24 h的組織清晰度不及染色2、12 h，染色2 h的組織清晰度最高，切片最為鮮亮，所以進一步設置小梯度時染色時間小于12 h。為了避免錯過最好的染色時間，小于2 h也設置2個梯度，以考察小于2 h是否會有更佳的效果，因此小梯度染色時間設為0.5、1、2、4、6、8 h。

從圖2可以看出，染色8 h時色彩暗淡，清晰度低；染色 6 h 組織的清晰度較好且均勻，但對比大量同時間段的切片染色效果可知，其染色穩定性差；染色4 h組織的清晰度較好但不均勻，其染色穩定性也差；染色2 h組織的清晰度高，均勻性好，其染色穩定性均比其他時間段要好；染色0.5、1 h時組織色彩較淺，清晰度不高，均勻性較差。本研究結果說明，番紅最佳的染色時間為2 h。

2.2 固綠單獨染色切片效果

觀察不同固綠染色時間的染色效果(圖3)得出，單獨采用固綠對組織進行染色其清晰度均不高，不便于對花芽分化進程的觀察。

2.3 番紅-固綠對染切片染色效果分析

番紅-固綠對染時番紅采用的最佳染色時間為2 h，固綠設置10、20、30 s 3個染色時間梯度。比較幾種方法可知，固綠染色10、20 s效果均不清晰；固綠染色30 s效果清晰，但2個固綠染色30 s的處理中30 s-1的顏色明顯深于30 s-2(圖4)。對比大量同時間段的切片染色效果，發現番紅-固綠對染穩定性不高，說明番紅-固綠對染不適合對普通白菜花芽分化進程的觀察。

2.4 普通白菜花芽分化形態學鑒定

采用番紅單染2 h制作石蠟切片，進行顯微鏡觀察，將普通白菜花芽分化(葉原基經花原基到單花器官分化)分為圖5中的8個階段：0級(營養生長期)，生長點比較平坦，周緣有許多尖錐形的葉原基(圖5-A)；1級(營養生長向生殖生長過渡期)，莖端生長點開始膨大，寬度、高度同時增加，其頂端逐漸變圓，隆起呈半圓狀突起，生長點周緣仍不斷分化葉原基，根據發育時間的長短，生長點隆起的高低稍有差異(圖 5-B、C)；2級(花原基分化初期)，莖端生長點繼續膨大伸長，具有1個中心圓突起，四周有2～3個小圓突起，即為花原基，這個階段葉原基分化停止(圖5-D)；3級(花原基分化盛期)，周圍圓突起陸續增加，并不斷發育增大伸長，可明顯看到形成圓突群，花原基伸長長短依分化時間長短而異(圖5-E、F)；4級(花柄伸長期)，花柄開始伸長，但不太長，萼片沒有分化，圓突群分化為花蕾雛形(圖5-G)；5級(花萼原基分化期)，花柄繼續伸長，主莖第1花原基頂端周緣對稱分化出新月形突起，即為花萼原基(圖5-H)；6級(雌雄蕊原基分化期)，當花萼伸長將包圍整個花原基時，在花芽中心生長錐基部，萼片腋間出現的對稱突起為雄蕊原基，隨著雄蕊原基的發育，花芽中心生長錐頂部凹陷，四周呈現環狀突起，即雌蕊原基開始分化(圖5-I、J)；7級(花瓣原基分化期)，在雌蕊原基分化的同時，萼片原基的內側對稱分化出箭頭狀突起，即為花瓣原基(圖5-K)。至此，普通白菜已完成其主枝從葉原基經花原基到單花器官的分化，再經過大約2～3 d的時間，花蕾便肉眼可見。

普通白菜花芽分化從主枝生長點開始，生長點原基按照由外向內的次序依次進行，主枝先進行，一級側枝次之。當主枝花柄伸長時，一級側枝已經形成，但生長點較為平坦，還未開始花芽分化(圖6-A)；當主枝萼片原基形成時，生長點隆起呈半球狀，一級側枝花芽進入分化期(圖6-B)；當主枝達到雄、雌蕊原基分化期，最早長出的一級側枝花芽進入萼片分化期(圖6-C)，隨后的分化過程同主花序；一級側枝花芽分化的次序由頂部向基部依次進行(圖6-D)。按照這樣的規律，普通白菜完成單株花芽分化。

3 討論

3.1 不同染色方法和時間的篩選

番紅、固綠為植物組織學最常用的2種染料，番紅的染色時間一般為2～24 h，固綠一般為10～60 s[16]。對于不同材料和染色試劑，染色時間應該根據試驗材料、取樣的時期和部位，在借鑒他人成熟方法的基礎上進行探索。于曉剛等研究指出，粳稻花后不同時間的穎果最佳染色時間差異很大，發育前期的穎果幼嫩，固綠染色時間需要20～25 s，而后期的穎果染色時間只需要10～20 s[5]。王寧等指出，草莓采用番紅-固綠對染的效果優于單獨采用番紅或固綠[17]。本試驗結果表明，單獨采用番紅染色時，設置0.5～24 h染色，觀察同時間段的切片染色效果，結果表明，2 h染色效果最均勻、穩定，且色彩鮮亮，便于觀察；單獨采用固綠染色時，普通白菜組織結構不夠清晰，不便于觀察；采用番紅-固綠對染的穩定性均相對較差。因此，對75#普通白菜花芽的分化過程進行觀察中采用番紅單獨染色2 h。

3.2 普通白菜花芽分化的形態學研究

在白菜的花芽分化研究中，李曙軒等對于白菜的分化過程僅觀察到花原基分化結束，并將該過程分為6級，對于單花器官的發生沒有進行報道[9]；王真真等未涉及不結球白菜花原基的發生盛期、側枝花芽的發生過程，將花芽分化進程分為7級[10]。本試驗對上述研究進行了詳細補充，將普通白菜花芽分化過程分為8級，并完善了側枝花芽的分化過程。本試驗中花柄伸長時期就已經觀察到側枝花芽的發生，與李曙軒等的研究結果[9]一致，但早于王真真等的研究結果[10]，因此關于普通白菜側枝花芽的發生時期還有待進一步研究。本試驗觀察到側枝花芽的發生順序為由頂部向基部依次分化，與惠麥俠等對于大白菜的研究結果[18]一致，但與陳機的研究結果[19]不一致，可見對于白菜類蔬菜側枝花芽分化的順序還有待進一步研究。

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