嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的分離鑒定及單質硫氧化特性

李靜泉， 姜 燕， 許繼飛， 趙 吉

(內蒙古大學環境與資源學院/內蒙古自治區環境污染控制與廢物資源化重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010021)

煤炭燃燒過程中釋放的二氧化硫是造成大氣污染的主要原因之一，對生態環境和人體健康危害嚴重。煤炭微生物脫硫因其效率高、成本低、二次污染小等特點[1-2]越來越受到研究者的關注。嗜酸氧化硫硫桿菌為化能自養型細菌，廣泛存在于酸性礦山廢水和礦區土壤等環境中，是脫硫微生物的主要代表之一，不僅能應用于硫的氧化脫除，還能應用于污泥淋濾去除重金屬、生物處理降低鹽堿地pH值、尾礦冶金等領域[3-6]。高效脫硫菌株是微生物脫硫應用于環保領域的關鍵。因此，分離和篩選高效脫硫菌株是一項基礎且非常重要的研究工作。

胡瑜等從高硫煤矸石山酸性廢水中分離得到的嗜酸氧化硫硫桿菌CMTT-32對單質硫的氧化率在第11天時達到 65.6%，日產硫酸的量最高達3 g/L[7]。楊期勇等分離篩選得到1株嗜酸氧化硫硫桿菌JJU-1，其培養基的pH值在第6天時約下降至1.0，在第9天時約下降至0.7，且研究發現硫粉投加量對菌株JJU-1的氧化產酸量有影響[8]。呂早生等從礦山土樣中分離得到1株嗜酸氧化硫硫桿菌HY-01，在培養180 h后其培養基的pH值約下降至1.0，對應的D600 nm略大于1.0，但菌株HY-01不能利用Na2S2O3[9]。嗜酸氧化硫硫桿菌QH-1在1周內可將培養基的pH值降到1.0以下，生長穩定期時培養基的pH值為0.6，同時試驗發現菌株 QH-1 對Zn2+、Cu2+有一定的耐受性，而對Mo2+的耐受性較差[10]。嗜酸氧化硫硫桿菌TS6在培養基初始pH值為2～6的條件下能夠在3～4 d內將pH值約降至1.0，而當初始pH值為8時則難使pH值明顯下降，且菌株TS6對Cr3+、Cu2+、Zn2+、Ni2+具有耐受性[11]。

本試驗從高硫煤礦儲煤區的土壤中分離篩選出1株高效脫硫菌，并研究該菌株的單質硫氧化曲線，及培養基中單質硫初始量和金屬離子對單質硫氧化過程的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品采集 土壤樣品，采自內蒙古自治區烏海市烏達煤礦儲煤區。

1.1.2 培養基 Waksman培養基：0.200 g(NH4)2SO4，3.000 g K2HPO4·3H2O，0.500 g MgSO4·7H2O，0.126 g CaCl2·2H2O，10.000 g S0，1 000 mL蒸餾水，按試驗需要用HCl溶液調節培養基的pH值。S0先經紫外照射滅菌再與高壓蒸汽滅菌的培養基的其余部分進行混合。用于菌株的液體培養。

Starky-Na2S2O3-瓊脂培養基：2.000 g(NH4)2SO4，0.500 g MgSO4·7H2O，0.250 g CaCl2·2H2O，3.000 g KH2PO4，0.001 g FeSO4·7H2O，10.000 g 400 g/L Na2S2O3，20.000 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水。濃度為400 g/L的Na2S2O3母液先經過濾除菌再與高壓蒸汽滅菌的培養基其余部分在50～60 ℃進行混合。用于菌株的平板固體培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株富集培養與分離 取5 g土壤樣品加入盛有 100 mL Waksman培養基(pH值為2.0)的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min條件下培養7 d，在培養過程中如有化能自養菌的生長則培養基將變為渾濁的乳白色。取5 mL培養液加入1瓶新的盛有100 mL Waksman培養基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min條件下培養7 d，連續富集培養6代。將最后1次的富集液進行梯度稀釋，分別取10-3、10-4、10-5稀釋液各100 μL加到Starky-Na2S2O3-瓊脂培養基上，涂布均勻，倒置于30 ℃恒溫培養箱中培養。挑取形態不同的菌落于裝有20 mL Waksman培養基的50 mL錐形瓶中，在 30 ℃、160 r/min條件下培養，驗證單質硫氧化功能。同時通過固體平板劃線法進行驗證，直到分離得到純的具有脫硫功能的菌株。

1.2.2 菌株鑒定 在Starky-Na2S2O3-瓊脂培養基上觀察菌落形態，對菌株進行革蘭氏染色，在顯微鏡下對菌株個體進行觀察。菌株16S rRNA基因PCR擴增所用引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R：5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′。16S rRNA基因PCR擴增程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，29次循環；72 ℃ 10 min。基因測序結果通過Blast、MEGA 4.1進行分析和構建系統進化樹。

1.2.3 嗜酸氧化硫硫桿菌的單質硫氧化特性研究

1.2.3.1 種子液的準備 將菌液按3%(體積比)的接種量接入盛有初始pH值為2.0的Waksman培養基的錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min條件下培養8 d，靜置沉淀3 min以去除培養液中的單質硫，吸取上層菌液作為種子液。

1.2.3.2 嗜酸氧化硫硫桿菌的單質硫氧化曲線 Waksman培養基的初始pH值調節為2.3，按3%(體積比)的接種量向盛有20 mL Waksman培養基的50 mL錐形瓶中接種種子液，種子液的D600 nm為0.22。在30 ℃、160 r/min搖床中培養，每2 d測定1次培養液的SO42-濃度、pH值、D600 nm。每組試驗設3個重復。

在混凝土灌注之前，要保證混凝土隔水栓與初灌料斗以及相關工作人員到位。安排專業工作人員檢測并評估坍落指數，以保證能夠與施工標準要求相適應。

1.2.3.3 單質硫不同初始量對嗜酸氧化硫硫桿菌單質硫氧化效率的影響 將Waksman培養基中單質硫的初始量分別設為0.1%、2%、3%(質量體積比)，培養基的初始pH值調為2.0。按3%(體積比)的接種量向盛有20 mL Waksman培養基的50 mL錐形瓶中接種種子液，種子液的D600 nm為0.22。在30 ℃、160 r/min搖床中培養，每2 d測定1次培養液的SO42-濃度、pH值。每組試驗設3個重復。

1.2.3.4 不同金屬離子對嗜酸氧化硫硫桿菌單質硫氧化效率的影響 選用的金屬離子分別為Fe3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、K+，向初始pH值為2.0的Waksman培養基中加入各金屬離子，使培養基中該金屬離子的濃度均增加1 mmol/L，同時設置在Waksman培養基中不添加金屬離子作為對照。

接種量均為3%(體積比)，種子液的D600 nm為0.27，培養條件為 30 ℃、160 r/min搖床培養。培養第7天時取樣測定SO42-濃度、pH值。每組試驗設3個重復。

1.2.3.5 單質硫氧化率的計算 根據各取樣點的樣品與培養基中初始SO42-濃度之差和培養基中初始加入單質硫的量來計算單質硫氧化率。

式中：r為單質硫氧化率；C2為各取樣點樣品中SO42-濃度的平均值，mg/L；C1為培養基中初始SO42-濃度的平均值，mg/L；m為20 mL培養基中單質硫的初始量，mg。

1.2.4 取樣方法和檢測儀器

在取樣測定SO42-濃度、pH值時，將菌液在5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，隨后抽濾，使溶液澄清，用pH計測定pH值，用離子色譜儀測定SO42-濃度。

1.2.4.2 檢測儀器 離子色譜儀(881 Compact IC pro-Anion)，購自瑞士萬通中國有限公司；紫外可見分光光度計(TU-1810)，購自北京普析通用儀器有限責任公司；pH計(ST2100)，購自奧豪斯儀器(常州)有限公司。

2 結果與分析

2.1 脫硫菌株的分離、鑒定

從土壤樣品中分離篩選出1株高效脫硫菌株，革蘭氏染色呈陰性，桿狀菌，菌落透明，在Starky-Na2S2O3-瓊脂培養基上形成云霧狀氧化圈，能夠在初始pH值為2.0的Waksman培養基中生長且最終pH值低于1.0。由圖1可知，菌株DS1的16S rRNA基因序列與模式菌株AcidithiobacillusthiooxidansDSM 14887、A.albertensisDSM 14366的16S rRNA基因序列相似性最高，均為99%。因此，將菌株DS1命名為嗜酸氧化硫硫桿菌DS1(A.thiooxidansDS1)[12]。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的16S rRNA基因序列GenBank登錄號為KX618878。

2.2 嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的單質硫氧化曲線

由圖2可知，在單質硫初始量為1%的Waksman培養基中接種嗜酸氧化硫硫桿菌DS1后，在0、2、4、6、8、10、12、14 d時，培養基中SO42-的平均濃度分別為448.4、3 656.9、13 326.7、14 820.8、15 327.1、20 237.8、21 926.4、22 125.1 mg/L，培養基的pH值平均值分別為 2.22、1.58、1.06、0.84、0.83、0.72、0.71、0.64，培養基的D600 nm平均值分別為0.008、0.022、0.135、0.136、0.189、0.194、0.147、0.120。而未接菌的培養基中SO42-濃度和pH值基本保持不變。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在2、4、6、8、10、12、14 d時的單質硫氧化率分別為10.70%、42.93%、47.91%、49.60%、65.96%、71.59%、72.26%。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在12 d時單質硫氧化率達到 71.59%，SO42-濃度為21 926.4 mg/L；之后增長緩慢，14 d時單質硫氧化率為72.26%，SO42-濃度為 22 125.1 mg/L。培養基的pH值由0 d時的2.22在14 d時降到 0.64。在硫氧化過程中，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的生長量在8、10 d時較高，其D600 nm分別為0.189、0.194。可見嗜酸氧化硫硫桿菌DS1的單個個體對單質硫具有高效的氧化能力。

2.3 單質硫不同初始量對嗜酸氧化硫硫桿菌DS1氧化單質硫效率的影響

由圖3-a可知，在單質硫初始量為0.1%的Waksman培養基中接種嗜酸氧化硫硫桿菌DS1后，在0、2、4、6、8、10、12、14 d時，培養基中SO42-濃度的平均值分別為998.1、1 089.5、1 300.0、1 558.9、2 235.9、2 769.7、3 483.0、3 739.9 mg/L，培養基的pH值平均值分別為1.67、1.57、1.49、1.27、1.25、1.15、1.00、0.96。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在2、4、6、8、10、12、14 d時的單質硫氧化率分別為3.05%、10.06%、18.69%、41.26%、59.05%、82.83%、91.39%。

由圖3-b可知，在單質硫初始量為2%的Waksman培養基中接種嗜酸氧化硫硫桿菌DS1后，在0、2、4、6、8、10、12、14 d 時，培養基中SO42-濃度的平均值分別為576.5、3 804.1、13 051.8、15 584.5、32 475.5、43 855.4、46 046.7、46 016.4 mg/L，培養基的pH值平均值分別為 1.71、1.02、0.57、0.54、0.30、0.21、0.15、0.15。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在2、4、6、8、10、12、14 d時的單質硫氧化率分別為5.38%、20.79%、25.01%、53.17%、72.13%、75.78%、75.73%。

由圖3-c可知，在單質硫初始量為3%的Waksman培養基中接種嗜酸氧化硫硫桿菌DS1后，在0、2、4、6、8、10、12、14 d 時，培養基中SO42-濃度的平均值分別為762.4、3 148.1、11 701.3、25 446.7、30 593.1、41 523.6、49 677.2、52 815.4 mg/L，培養基的pH值平均值分別為 1.68、1.00、0.55、0.39、0.31、0.16、0.09、0.06。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在2、4、6、8、10、12、14 d時的單質硫氧化率分別為2.65%、12.15%、27.43%、33.15%、45.29%、54.35%、57.84%。

綜合來看，14 d時嗜酸氧化硫硫桿菌DS1在單質硫初始量為0.1%條件下的單質硫氧化率為91.39%，在單質硫初始量為2%條件下的單質硫氧化率為75.73%，在單質硫初始量為3%條件下的單質硫氧化率為57.84%，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1對單質硫的氧化率隨著單質硫初始量的增加而降低。可見，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1對低含量單質硫(單質硫初始量為0.1%)具有較高的單質硫氧化率，而對高含量單質硫(單質硫初始量為3%)也有不錯的氧化效果，14 d時單質硫氧化率接近60%。同時，培養液的pH值在單質硫初始量為2%的條件下在14 d時下降至0.15，在單質硫初始量為3%的條件下在14 d時下降至0.06，說明嗜酸氧化硫硫桿菌DS1具有較強的產酸能力。

2.4 添加不同金屬離子對嗜酸氧化硫硫桿菌DS1氧化單質硫效率的影響

由圖4可知，分別向Waksman培養基中添加不同種類金屬離子，培養7 d時測得添加Fe3+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+培養基中SO42-濃度的平均值分別為 18 272.7、2 150.8、18 470.7、17 406.8、17 307.8、15 817.9、15 061.0、15 273.2、15 602.9 mg/L，而未在培養基中添加金屬離子的對照組試驗中SO42-濃度為13 987.3 mg/L。由圖5可知，添加Fe3+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+培養基中pH值平均值分別為0.42、1.17、0.39、0.42、0.43、0.44、0.44、0.46、0.44，而未向培養基中添加金屬離子的對照組試驗中培養基的pH值平均值為0.47。試驗結果顯示，除Co2+對嗜酸氧化硫硫桿菌DS1氧化單質硫具有明顯的抑制作用外，Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+均對嗜酸氧化硫硫桿菌DS1氧化單質硫有促進作用，其中，Cu2+、Fe3+的促進作用較強，Ni2+、Zn2+的促進作用次之，K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+的促進作用相對較弱。可見嗜酸氧化硫硫桿菌DS1對金屬離子具有較強的耐受能力。

3 討論與結論

嗜酸氧化硫硫桿菌DS1具有高效的脫硫能力，單質硫初始量為0.1%，在14 d時其單質硫氧化率可達91.39%，對低含量單質硫氧化徹底；單質硫初始量為1%、2%，在14 d時其單質硫氧化率均高于70%，可見嗜酸氧化硫硫桿菌DS1能夠在單質硫含量較廣的范圍內保持高效的氧化能力，并且在 14 d 時培養基中SO42-濃度分別高于22 000、46 000 mg/L；單質硫初始量為3%時其單質硫氧化率約為60%，培養基中SO42-濃度最終約為53 000 mg/L。培養液pH值的降低體現了脫硫微生物的產酸能力，同時也體現了菌株的脫硫能力。嗜酸氧化硫硫桿菌DS1具有較強的產酸能力，在單質硫初始量為2%、3%的條件下其培養液pH值在14 d時分別下降至0.15、0.06。在已報道的脫硫微生物中，嗜酸氧化硫硫桿菌CMTT-32在11 d時對單質硫的氧化率達65.6%，pH值降到0.8左右，20 d時培養液中SO42-濃度達到22 760 mg/L[7]；嗜酸氧化硫硫桿菌JJU-1隨著培養基中單質硫初始量的增加，其培養液的pH值下降速度變快，產酸效果較好，與菌株DS1的情況一致，但培養8 d后其培養液的pH值降到0.7左右[8]；嗜酸氧化硫硫桿菌Tt-1在單質硫氧化過程中培養8 d后其培養液的pH值降到1.0左右[13]；嗜酸氧化亞鐵硫桿菌T1在氧化單質硫為硫酸根過程中，培養144 h后其培養基的pH值由初始的 2.42 最終降為1.66[14]；與之相比，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1具有更強的單質硫氧化和產酸能力。此外，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1對金屬離子的耐受性試驗結果表明，其對Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+等多種金屬離子具有耐受能力，在生物冶金、污泥淋濾去除重金屬等方面具有廣闊的應用前景。

嗜酸氧化硫硫桿菌氧化單質硫生成硫酸根的過程為先由單質硫氧化生成亞硫酸根，再由亞硫酸根進一步氧化生成硫酸根，同嗜酸氧化亞鐵硫桿菌氧化單質硫的過程相同[15]。而亞硫酸根離子作為單質硫氧化的中間代謝產物能夠強烈抑制離子氧化酶的活性，不同的脫硫菌對亞硫酸根的敏感程度不同從而會影響其脫硫效率[16]。而且嗜酸氧化硫硫桿菌的不同菌株的基因組之間可能存在特異性以適應其生存的環境[17]。因此，對于具有強產酸能力的嗜酸氧化硫硫桿菌DS1，其基因組信息值得被挖掘。另外，雖然菌株DS1的產酸能力較強，但在Waksman培養基中的生長量偏低，須改善其生長條件提高其生長量。嗜酸氧化硫硫桿菌和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌均在生物脫硫、生物冶金、生物浸磷、污泥淋濾去除重金屬等方面具有應用價值[18-22]，因此，嗜酸氧化硫硫桿菌DS1與嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的混合使用具有研究價值。

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