我國耕地重金屬污染現狀及固氮菌在其修復中的作用

劉 晨， 賈鳳安， 呂 睿

(陜西省微生物研究所，陜西西安 710043)

隨著我國工業化的推進及城鎮的加速建設，排放到環境中的工業廢料及有毒污染物也呈現急速上升的趨勢。由于重金屬在自然環境中代謝慢，還會轉移并累積到植物中，對動物和人體產生毒害作用，因此會對生態系統造成長期的負面影響。許多重金屬即使在很低的濃度下，毒性仍然很大。砷(As)、鎘(Cd)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鉛(Pb)、汞(Hg)、鎳(Ni)等重金屬不僅對細胞有毒害作用，還會致癌以及導致突變[1]。可以預見在很長一段時期內經濟發展仍然是我國的發展重點，因此對環境的修復就成為經濟持續發展的關鍵因素。研究表明，土壤微生物的數量以及酶活性與土壤養分含量之間存在相關關系，固氮菌可有效改善土壤環境，增加土壤有機質含量，促進植物根系對氮元素的吸收，提高土壤微生物的酶活性，活化土壤中的礦質養分[2]。本研究以固氮菌為研究對象，在總結我國耕地重金屬污染現狀及近期對固氮菌在重金屬污染土壤作用的基礎上，探討固氮菌修復重金屬土壤的可行性。

1 重金屬污染

土壤重金屬污染是指比重大于5或4[主要包括銅、鋅(Zn)、鎘、鉛、汞(Hg)、鉻、砷、鎳、鈷(Co)]的金屬或其化合物在土壤環境中所造成的污染[3]。

1.1 我國耕地重金屬污染現狀

2011年11月聯合國糧食及農業組織報告稱，全球25%的耕地嚴重退化，其中來自污染方面的退化原因不可忽視[4]。 2014年4月17日環保部和國土資源部聯合發布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，我國耕地土壤環境質量堪憂，點位超標率為19.4%，其中輕微、輕度、中度、重度污染點位比例分別為13.7%、2.8%、1.8%、1.1%，其中重金屬污染問題比較突出[5]。耕地土壤重金屬污染給農民帶來了經濟利益和健康利益的雙重損害。目前，我國受Cd、As、Cr、Pb等重金屬污染的耕地面積近2 000萬hm2，約占總耕地面積的1/5。我國每年因重金屬污染導致的糧食減產超過1×107t，經濟損失超過200億元[6]；與常見的大氣污染、水污染、工業固體廢棄物污染相比，土壤重金屬污染具有不可見性和隱蔽性。土壤重金屬污染日益嚴重導致土壤肥力退化、農作物產量降低和品質下降，嚴重影響環境質量和經濟的可持續發展，威脅到人們的食品安全[7]。據統計，從2009年起至今，我國發生的重大特大重金屬污染事件幾十余起，已經給人們的生命安全造成極大的危害[8-9]。

1.2 污染來源

土壤中的重金屬來源較多，除內源污染外其余都是與人類工業生產、農業活動等相關的外源污染(表1)。其中，以工業來源及農業來源的污染對耕地的土質影響最為嚴重[10]。工業廢棄物是土壤重金屬的主要成因，主要來源于采礦業、化工業、金屬加工等。將工業廢水用于農田灌溉成為我國農業的普遍現象，結果導致耕地中重金屬的富集，最終這些重金屬會從污染的耕地中轉移到農作物中[11]。

1.2.1 工業來源 土壤中有70%重金屬來源于礦山開采和冶煉礦石開采[12]。尾礦是礦石開采的副產物，是礦石經磨細，選取有用成分后形成的廢棄物，其中包含的部分元素是重要的二次礦產資源，但在現有經濟技術條件下仍無法有效利用。由尾礦形成的固體礦物廢料，是固體工業廢料的主要成分。尾礦已成為全球范圍的難題，遍布墨西哥、美國、智利、秘魯、南非、印度、西班牙和澳大利亞等國家[13-14]。全世界每年排棄的尾礦和廢石約達300億t，裸露的尾礦堆通過風和水的傳播將污染擴散至周圍數萬公頃范圍，嚴重危害人類身體健康和全球生態環境[15-16]。我國現有2 700多座礦山尾礦庫，堆積尾礦約50億t[17]，其中每年排棄的尾礦約3億t，占用土地約20 km2[18]，嚴重破壞了周邊的環境和生態平衡，危及人體健康和礦產業的可持續發展。尾礦還是產生酸性礦山廢水(acid mine drainage，AMD)的重要源頭之一[19]，AMD的pH值一般在4以下，而且富含重金屬[Pb、Zn、Cu、Cd、Mn、Ni、As等]，這些生物毒性極高的酸性廢水是采礦業最嚴重的環境問題之一，直接排放可對下游的水生生態系統和陸地生態系統造成毀滅性的破壞。

表1 我國重金屬污染來源分類[5，9]

1.2.2 農業來源

1.2.2.1 污水灌溉 污水灌溉作為一種農業灌溉措施，具有悠久的歷史。有機污水灌溉除了提供水源和豐富的營養元素，同時其污水中的有害成分也會影響土壤質量和農作物品質[20]。我國污水灌溉污染的農田面積為 330萬hm2，平均污水灌溉農田每年接納工業污水6 645 t/hm2。據我國農業部對全國污水灌區進行的調查，在約140萬hm2的污水灌區中，遭受重金屬污染的土地面積占污水灌區面積的64.8%，其中輕度污染的占 46.7%，中度污染的占9.7%，嚴重污染的占8.4%[21]。

1.2.2.2 化肥濫用 為了提高作物的產量和質量，在農業生產中往往投入過量的含有鉛、鎘、汞、砷等重金屬的化肥。如磷肥的主要生產原料是磷礦石，天然伴生Cd，Cd的含量在0.10～571.00 mg/kg之間，平均含量為0.98 mg/kg[5]。由于每年都施用磷肥，而磷肥被植物利用的比例只有10%～20%，造成大部分Cd在土壤中不斷累積。不同種類重金屬的主要來源見表2。

表2 不同種類重金屬的主要來源

1.3 污染源的控制

對于污水灌溉帶來的重金屬污染早已有研究，如我國甘肅省白銀地區使用含As廢水灌溉農田導致全市16.3%的土壤As超過當地臨界值(25 mg/kg)，最高達149 mg/kg[22]，嚴重影響農業生產。但污水灌溉由來已久，并且在一定程度上緩解了農業用水的巨大缺口，立即禁止并不現實，還會衍生出一系列的問題。化肥是目前農作物增產的重要手段，我國以7%的耕地養活全世界20%的人口，與化肥的施用密不可分，目前還沒有更加綠色高效的替代物來取代化肥。

我國未來經濟發展仍將保持較高的增長速度，隨著工業化、城鎮化的加快推進，可以預見一定時期內重金屬等污染物排放仍將保持一定的增長勢頭，我國土壤重金屬污染形勢將越發嚴峻。因此，重金屬污染問題僅通過源頭“防”是不現實的，應著重從修復方面入手，控制及減輕污染范圍和程度。

2 重金屬污染土壤的修復方法

各種重金屬存在形態非常復雜。水溶態、交換態對植物最有效，活性最大，毒性最強，稱為可給態，將這2種形態轉變為穩定性更強的形態是降低其毒性的有效途徑之一[23]。

傳統的重金屬污染土壤修復技術通常采用物理和化學方法，如排土填埋法、稀釋法、淋洗法、物理分離法和電化學法等。其原理主要是通過減少土壤表層污染物的濃度，或增強土壤中污染物的穩定性使其水溶性、擴散性和生物有效性降低，從而減輕其危害。這些傳統的修復方法雖然治理效果較好、歷時短，但也有許多缺陷如成本高、難于管理、易造成二次污染、對環境擾動大[6]，同時這些技術還有一個重大缺陷，即當重金屬濃度低于100 mg/L時，很難被有效去除[24]。此外，大多數的重金屬鹽都是水溶性的，所以當這些重金屬以工業廢水的形式被排放時，很難用物理方法進行分離[25]。生物修復在這方面就顯示出了優勢，如利用微生物或植物進行生物吸附或利用生物體內累積等方法修復重金屬污染的土壤， 不僅能去除重金屬，還可以重建土壤的生態系統、恢復土壤活力(表3)。

3 固氮菌在重金屬污染土壤修復中的作用

氮素是植物生長必需的礦質元素，也是需求量最大的礦質元素[26]，重金屬污染區一般缺乏氮素，通過固氮菌可以方便、低成本地為污染地區土壤補充氮源，促進該地區的植株生長，使土壤環境進入良性循環，降低污染度，甚至使土壤趨于無污染。

3.1 作為污染/修復的重要指標

鑒于固氮菌在天然生態系統氮素循環中的重要作用，研究污染物脅迫對自生固氮菌的影響顯得更為重要。此外，由于植物生長周期比較長， 研究重金屬脅迫下的共生或聯合固氮作用往往所需時間較長而固氮菌受到脅迫后固氮作用迅速受到影響，便于及時監測。因此，土壤中固氮菌群數量、固氮酶活性的變化可作為土壤污染/修復的監測指標，建立有效的污染預警指標體系，為環境質量評價提供有益的參考[27]。

表3 不同土壤修復方法優劣勢比較

3.2 氮源補充

有研究表明[28]，三大微生物以及各生理類群對重金屬污染的敏感性大小分別表現為放線菌>細菌>真菌、自生固氮菌>氨化細菌>硝化細菌>反硝化細菌>纖維分解菌。可見在重金屬污染土壤生態環境條件下，參與氮素轉化的細菌生理類群往往受到的影響最為明顯。在重金屬脅迫下固氮菌數量的下降及固氮酶活性下降往往會導致該地區氮素缺乏，這也是土壤肥力下降的主要原因。所以，恢復土壤活力最直接有效的方法是對其進行氮源補充。目前，針對氮素缺乏的普遍做法是加大尿素等氮類化肥的施加。這一做法無異于飲鴆止渴，使土壤狀況陷入惡性循環。通過添加固氮菌類生物肥實現修復土壤的目的，才能起到從本質上改善土壤肥力，并實現整個環境的可持續性發展。

3.3 參與修復

微生物修復中的固氮菌修復重金屬土壤最近備受重視，該方法不僅能發揮微生物修復數量眾多、比表面積大、帶電、代謝活動旺盛等優勢，還具有通過多種方式影響土壤重金屬的活性等特點[29]，還能緩解因重金屬污染導致的土壤氮素減少、肥力下降問題。

3.4 固氮菌抵抗重金屬作用機制

(1)細胞表面吸附。由于微生物對重金屬具有很強的親和吸附性能，有毒金屬離子可以沉積在細胞的不同部位或結合到胞外基質上，或被輕度鰲合在可溶性或不溶性生物多聚物上。(2)重金屬的轉化作用。微生物能通過氧化還原、甲基化和去甲基化作用轉化重金屬，將有毒物質轉化成無毒或低毒物質。(3)輸出系統對重金屬的作用。其中有3種系統(RND、CDF和P-ATPase)介導二價金屬陽離子排出細胞[30]，目前這種輸出機制主要用于抗鎘和抗銅系統。(4)通過形成金屬硫化物及金屬磷化物達到抗重金屬的目的。(5)微生物是土壤中腐殖質形成的根源，而二價金屬離子可以與腐殖質絡合(圖1)，形成低毒的絡合態。一些固氮藍細菌和某些藻類能產生胞外聚合物如多糖、糖蛋白、脂多搪等，這些物質具有大量的陰離子基團，與重金屬離子形成絡合物而解毒。如在藻類中發現一種被稱為“植物鰲合蛋白”的多肽能與Cd、Cu、Zn等重金屬結合。在藍細菌中發現一種可以與重金屬強力鰲合的金屬硫蛋白(MT)，可通過其殘基上的硫基與金屬離子結合形成無毒或低毒絡合物。Vasundhara等發現，隨著培養基中重金屬(Cu、Ni)離子濃度的升高，圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)對重金屬的吸收量也增加，并產生一種誘導物質——硫醇，該物質是一種重金屬結合縮氨酸，與環境中的重金屬離子結合，從而降低其對細胞的毒性[31]。

4 存在問題

關于我國重金屬污染土壤的現狀及生物修復已有許多學者做了大量研究，總結下來我國耕地重金屬污染的現狀可以概括為：(1)以Cd、As、Pb、Cu、Cr、Hg等元素為主；(2)多種重金屬元素復合污染；(3)不同區域間因來源不同、污染程度不同又呈現一定的差異性。正是由于污染面積廣、污染源復雜、差異性明顯的現狀，使固氮菌對重金屬污染土壤的修復效果大打折扣。

4.1 重金屬污染程度及種類

固氮菌對重金屬的修復和耐受能力與其濃度有很大關系，一般在低濃度下固氮菌的生長及固氮作用還會被促進，但在高濃度下有明顯的抑制作用，二者一般呈負相關關系，同時這種相關性還與重金屬的種類有關[32]。有研究結果表明，隨著土壤中Cd、As、Pb、Cu含量的增加，固氮菌的固氮活性降低，而且4種重金屬元素的毒性大小為Cd>As>Cu>Pb。 El-Enany 等研究了2種藍細菌在含低濃度、中等濃度重金屬(Zn、Cd)污水處理下，它們的固氮活性均增加，但在高濃度下其代謝則受到抑制[33]。然而，Brookes等研究發現，即使是很低濃度的重金屬[乙二胺四乙酸(EDTA)浸提，Zn 30 mg/kg、Cu 15 mg/kg、Ni 2 mg/kg、Cd 2 mg/kg]試驗中的藍綠藻固氮強度降低了50%[34]。不同種類的固氮菌對不同重金屬甚至同一重金屬的敏感程度不一，不能同一定論。

4.2 土壤類型不同、pH值不同對固氮菌活性影響較大

重金屬離子對固氮菌的毒性與土壤的pH值密切相關。Obbard等利用溫室栽培白三葉草評價較低重金屬(Zn、Cd、Cu、Ni、Mn)含量的污泥對其根瘤菌數量及固氮效率的影響，發現土壤pH值為6.0左右時，污泥中一定濃度范圍內的重金屬離子對根瘤菌影響較小，但當pH值(5.0)較低時，根瘤菌對重金屬毒害的忍耐度降低，其數量及固氮活性均明顯下降[35-36]。一般來說，這幾種重金屬離子在酸性土壤中的有效性較大，在水溶液中其離子濃度隨pH值降低而增加。

4.3 復合污染

在土壤環境中，由單個污染物質構成的環境污染雖時有發生，但實際上絕對意義的單一污染是不存在的，污染多具伴生性和綜合性，即多種污染物形成復合污染[37]。有大量研究表明，在同樣濃度下，固氮菌對復合污染更為敏感[38-39]。

5 解決方法

5.1 增強固氮菌重金屬耐受性——菌種篩選

從各類重金屬污染環境篩選固氮菌的研究如胡佳頻等從鉀長石礦區中分離固氮菌，該研究從吉首鉀長石礦區共分離出自生固氮菌28株，所有固氮菌株均具有一定的解鉀活性[40]。其中活性最高的根瘤菌L13發酵液中有效鉀(K)含量達到 71.22 mg/L，有效氮(N)含量可達10.71 mg/L。李雯等從鐵尾礦植被恢復區篩選分離出48株具有固氮能力的菌株，其中固氮酶活力最高的Ec1固氮比活力可達到307.23 nmol/(mg·h)，再將Ec1接種到紫花苜蓿上，結果顯示磷酸酶、脲酶、土壤酶活性均有明顯增加，土壤養分含量均高于對照組[2]。

5.2 與其他菌群或介質、植物聯合使用

固氮菌只是微生物體系中一個很小的分支(圖2)，還有許多非固氮菌的微生物，雖然不能為重金屬污染土壤直接提供氮源，但對重金屬的吸附以及價態的改變作用是非常顯著的，如對重金屬抗性最強的真菌類[40]。

利用植物修復重金屬污染也是目前研究較多的生物修復手段之一，因為它與微生物修復一樣具有環境友好及有利于經濟可持續發展等特點。但單純依靠植物去除重金屬污染仍有一定的局限性，例如植物生長慢、生物量低、對金屬有選擇性、不適宜復合污染修復。研究表明，氮素是植物必需的生命元素和生長限制元素[42]。通過增施肥料可提高修復植物生長速度、生物量及重金屬積累量[43]，植物-固氮菌聯合修復是在植物修復的基礎上，與微生物形成互惠互利的聯合體來提高土壤重金屬污染修復效率[44]。許多植物都具有重金屬富集作用，如Sriprang等利用豆科植物與基因工程根瘤菌的共生關系，來修復土壤Cd的污染取得了成功[45]。李廷強等通過研究不同重金屬濃度下東南景天的根際微生物發現，Zn超積累的東南景天的根際微生物細菌數量、主要生理類群數量及微生物生物量碳含量顯著高于非超積累生態型，說明在重金屬超積累型植物聯合作用下，細菌對重金屬抗性更強，對污染土壤的修復能力也更強[46]。目前已發現的具有重金屬超積累能力的植物已有700余種，廣泛分布于50個科(表4)[47-53]。和固氮菌之間如何聯合，和哪種固氮菌進行聯合已成為一個具有巨大發掘空間的研究方向。

5.3 “一區一策”的治理理念(根據重金屬種類、pH值、種植作物不同給出具體方案)

我國土壤重金屬污染區域特征明顯，土壤屬性差異大，相應的重金屬污染物類型多樣，污染治理技術與模式在不同區域、 不同污染物類型及不同土地利用方式上實用效果差異顯著。重金屬污染治理必須考慮區域特點，在修復治理中充分體現“一區一策”的治理理念[54]。不同種類的固氮菌對不同重金屬敏感程度不一；不同重金屬復合，2種或幾種重金屬之間是互相拮抗還是強強聯合；固氮菌的抗性程度都須進一步研究。要固氮菌發揮固氮甚至是對重金屬土壤的修復作用，前提是保證固氮菌的活性，因此應以不同地區的不同污染類型、pH值、種植作物為出發點，有針對性地提供解決方案，通過前期從各種極端條件下篩選或遺傳學改造得到的固氮菌庫，給出適合當地生境的固氮菌，進一步與其他菌群、植物甚至介質相結合，最終實現重金屬污染的修復及土壤的活化作用。

表4 已報道的有重金屬修復能力的植物(中國)[48-53]

5.4 基因工程菌

基因工程菌(GEM)是指其遺傳物質經由DNA重組技術改造，增強或擴大某種菌對土壤水污泥等環境中化學物質的降解作用，使其獲得修復污染土壤的能力[55]。將重金屬抗性基因通過遺傳學手段整合進高效固氮菌或其他菌中，使其具有重金屬抗性，達到污染土壤生物學修復的目的。運用遺傳學手段獲得具有耐/抗重金屬的工程菌與大規模的菌株篩選相比成本較高，但是可降低盲目性，減少工作量。

重組菌可以在較惡劣的環境下生存下來并在多種復雜的環境條件下用作生物修復劑。表5列出了近期報道的一些對重金屬有修復作用的基因工程菌。基因工程菌也推動了“微生物傳感器”的發展，它可快速準確地測量污染地的污染程度。多種微生物傳感器一般設計出來用于檢測重金屬的污染程度，如Hg、Cd、Ni、Cu、As[56-57]。目前，基因工程技術被認為是土壤重金屬修復中最有希望的研究方向(表5)[58]。

表5 有重金屬修復能力的基因工程菌[59-70]

6 結論

工業化和城鎮化的快速發展，隨之而來的是嚴重的土壤重金屬污染和土壤活力退化[71-72]。固氮菌可有效改善土壤環境，增加土壤有機質含量，促進植物根系對氮元素的吸收，能增強宿主植物的抗病性和抗逆性。因此，以固氮菌為修復劑用于修復重金屬污染土壤成為生物修復中的一個新興方向。但這一方法也存在限制，即固氮菌本質上是細菌，所以對重金屬的耐受力存在上限，同時重金屬污染土壤多為復合污染且污染情況千差萬別，僅僅依靠目前從自然生境中分離得到的固氮菌完成生物修復存在一定難度。

因此，固氮菌和超積累植物及其他高效降解微生物的篩選、合理搭配、修復機制的探索和基于植物與微生物聯合修復的根際圈效應、以廣義生物修復為核心的聯合修復以及修復強化措施的研究將成為污染土壤生態修復研究的核心內容[73]。此外通過對固氮菌進行遺傳學改造，提高它對重金屬的耐受力甚至賦予它本身并不具備的對重金屬的吸附、轉運、分解等能力來完成對重金屬污染土壤的生物修復，也將成為今后重金屬污染土壤生物學修復的研究重點。我國約有 0.1億hm2的重金屬污染土壤，地域上大部分分布于南方亞熱帶水熱資源豐富地區，修復治理后的土壤具有巨大的利用潛力。中度和輕度污染的土壤修復后，單位面積糧食(水稻)產量可以提高10%以上，種植業還可得到發展；重度污染的土壤修復治理后，土壤生態功能得到恢復，通過適當利用，農田每年有15 000元/hm2左右的產值[54]。污染土壤的治理修復，不僅可以為國家增加糧食產量，同時有助于改善和維護污染區域民眾健康。土壤污染是事關農業、農村、全民健康和國家根本利益的大事，其修復治理可形成巨大的經濟、社會和生態效益。

參考文獻：

[1]Salem H M，Eweida E A，Farag A . Heavy metals in drinking water and their environmental impact on human health[C]//ICEHM. Egypt：Cairo University，2000：542-556.

[2]李 雯，閻愛華，黃秋嫻，等. 尾礦區不同植被恢復模式下高效固氮菌的篩選及Biolog鑒定[J]. 生態學報，2014，34(9)：2329-2337.

[3]Adriano D C. Heavy metals release in soils[J]. Soil Science，2002，167(11)：771-779.

[4]陳 浩，楊達源，金曉斌. 石河子墾區耕地土壤污染問題分析[J]. 干旱區資源與環境，2013，27(2)：186-192.

[5]蔡美芳，李開明，謝丹平，等. 我國耕地土壤重金屬污染現狀與防治對策研究[J]. 環境科學與技術，2014，37(120)：223-230.

[6]曾學云，吳群河. 重金屬污染土壤植物修復基本機理及其發展方向[J]. 環境污染與防治，2004，8(4)：76-81.

[7]林 強. 我國的土壤污染現狀及其防治對策[J]. 福建水土保持，2004，16(1)：25-28.

[8]Jiang N. Hazard highlight of pollution of heavy metals[J]. Enviromental Economy，2011，10：10-14.

[9]張 艷，鄧揚悟，羅仙平，等. 土壤重金屬污染以及微生物修復技術探討[J]. 有色金屬科學與工程，2012，3(1)：63-66.

[10]Athar R，Ahmad M. Heavy metal toxicity：effect on plant growth and metal uptake by wheat，and on free living azotobacter[J]. Water Air & Soil Pollution，2002，138(1/2/3/4)：165-180.

[11]Ramteke S，Sahu B L，Dahariya N S，et al. Heavy metal contamination of vegetables[J]. Journal of Environmental Protection，2016，7(7)：996-1004.

[12]杜 鵑. 重金屬污染七成重金屬源于開采礦[N]. 廣州日報，2015-09-18(08).

[13]Gulsen T. Inhibition of acid mine drainage and immobilization of heavy metals from copper flotation tailings using a marble cutting waste[J]. International Journal of Minerals，Metallurgy，and Materials，2016，23(1)：1-6.

[14]Tordoff G M，Baker A J M，Willis A J. Current approaches to the revegetation and reclamation of metalliferous mine wastes[J]. Chemosphere，2000，41(1)：219-228.

[15]Hun-Dorris T. Groundwater problems spring to the surface[J]. Environmental Health Perspectives，2004，112(3)：159.

[16]González R C，González-Chávez M C A. Metal accumulation in wild plants surrounding mining wastes[J]. Environmental Pollution，2006，144(1)：84-92.

[17]許寶健. 危險的隱患沉寂的金山[N]. 中國環境報，2009-03-06(06).

[18]祝玉學. 關于尾礦庫工程中幾個問題的討論[J]. 金屬礦山，1998(10)：7-10.

[19]Johnson D B. Acidophilic microbial communities：candidates for bioremediation of acidic mine effluents[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，1995，35(1/2/3)：41-58.

[20]Chen Y，Wang C X，Wang Z J. Residues of source identification of persisitent organic pollutants in farmland soil irrigated by effluents from biological treatment plants[J]. Environ Internat，2005，31(6)：778- 783.

[21]丁真真. 中國農田土壤重金屬污染與其植物修復研究[J]. 水土保持研究，2007，14(3)：19-20.

[22]徐紅寧，許嘉林. 我國砷異常區的成因及分布[J]. 土壤，1996，28(2)：80-84.

[23]申進玲，陳 蕾，李曉蕙，等. 固氮菌及其共生體系修復土壤重金屬污染[J]. 中國農村小康科技，2006(6)：68-69.

[24]Ahluwalia S S，Goyal D. Microbial and plant derived biomass for removal of heavy metals from wastewater[J]. Bioresource Technology，2007，98(12)：2243-2257.

[25]Hussein H，Farag S，Moawad H. Isolation and characterization ofPseudomonasresistant to heavy metals contaminants[J]. Arab J Biotechnol，2004，7：13-22.

[26]Souza E M，Leda S C，Luciano F H，et al. Use of nitrogen-fixing bacteria to improve agricultural productivity[J]. BMC Proceedings，2014，8(4)：23-31.

[27]廖瑞章，金荔枝，申淑玲. 利用固氮菌為指標確定土壤重金屬毒性研究[J]. 農業環境保護，1989，8(4)：5-9.

[28]滕 應，黃昌勇，龍 健，等. 鉛鋅銀尾礦污染區土壤微生物區系及主要生理類群研究[J]農業環境科學學報，2003，22(4)：408-411.

[29]Guo X J，Huang Q Y，Chen W L. Effect of microorganisms on the mobility of heavy metals in soil environments[J]. China Appl Environ Biol，2001，8(1)：105-110.

[30]Nies D H. Efflux-mediated heavy metal resistance in prokaryotes[J]. FEMS Microbiology Reviews，2003，27(2/3)：313-339.

[31]Vasundhara G，Jayashree G，Kurup G M. Sequestration of nickel and copper byAzotobacterchroococcumSB1[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2004，72(6)：1122-1127.

[32]王淑芳，胡連生，紀有海，等. 重金屬污染黑土中固氮菌及反硝化菌作用強度的測定[J]. 應用生態學報，1991，2(2)：174-177.

[33]El-Enany A E，Issa A A. Cyanobacteria as a biosorbent of heavy metals in sewage water[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology，2000，8(2)：95-101.

[34]Brookes P C. The use of microbial parameters in monitoring soil pollution by heavy metals[J]. Biology and Fertility of Soils，1995，19(4)：269-279.

[35]Obbard J P. Ecotoxicological assessment of heavy metals in sewage sludge amended soils[J]. Applied Geochemistry，2001，16(11)：1405-1411.

[36]宣 瑛. 鎘和乙草胺復合污染對早地土壤自生固氮菌種群和生物活性的影響[D]. 杭州：浙江大學，2006：6-16.

[37]周東美，王慎強，陳懷滿. 土壤中有機污染物-重金屬復合污染的交互作用[J]. 土壤與環境，2000，9(2)：143-145.

[38]賈會娟，祝 惠，袁 星，等. 克百威與鎘單一及復合污染對土壤好氣性自生固氮菌數量的影響[J]. 農業環境科學學報，2007，26(10)：529-532.

[39]黃 錚. 銅單一污染與銅鎘復合污染對稻田土攘微生態的影響及抗性菌株的分離與特征研究[D]. 杭州：浙江大學，2006：4-7.

[40]胡佳頻，湯 鵬，易浪波，等. 鉀長石礦區土壤固氮菌的多樣性分析[J]. 中國微生態學雜志，2015，27(10)：1127-1130.

[41]唐鳳灶. 安徽銅陵銅尾礦原生演替過程中的土壤固氮菌研究[D]. 廣州：中山大學，2010：2-3.

[42]Vitousek P M，Porder S，Houlton B Z，et al. Terrestrial phosphorus limitation：mechanisms，implications，and nitrogen-phosphorus interactions[J]. Ecological Applications，2010，20(1)：5-15.

[43]楊容孑，劉柿良，宋會興，等. 不同氮形態對龍葵鎘積累、抗氧化系統和氮同化的影響[J]. 生態環境學報，2016，25(4)：715-723.

[44]Epelde L，Becerril J M，Barrutia O，et al. Interactions between plant and rhizosphere microbial communities in a metalliferous soil[J]. Environmental Pollution，2010，158(5)：1576-1583.

[45]Sriprang R，Hayashi M，Yamashita M，et al. A novel bioremediation system for heavy metals using the symbiosis between leguminous plant and genetically engineered rhizobia[J]. Journal of Biotechnology，2002，99(3)：279-293.

[46]李廷強，舒欽紅，楊肖娥. 不同程度重金屬污染土壤對東南景天根際土壤微生物特征的影響[J]. 浙江大學學報(農業與生命科學版)，2008，34(6)：692-698.

[47]陳一萍. 重金屬超積累植物的研究進展[J]. 環境科學與管理，2008，33(3)：20-24.

[48]張學洪，羅亞平，黃海濤，等. 一種新發現的濕生鉻超積累植物——李氏禾[J]. 生態學報，2006，3(26)：950-953.

[49]祝鵬飛，寧 平，曾向東，等. 有色冶煉污染區土壤污染及重金屬超積累植物的研究[J]. 安全與環境工程，2006，1(13)：48-52.

[50]魏樹和，周啟星，王 新. 超積累植物龍葵及其對鎘的富集特征[J]. 環境科學，2005，3(26)：167-170.

[51]魏正貴，張惠娟，李輝信，等. 稀土元素超積累植物研究進展[J]. 中國稀土學報，2006，24(1)：1-4.

[52]吳雙桃，吳曉芙，胡曰利，等. 鉛鋅冶煉廠土壤污染及重金屬富集植物的研究[J]. 生態環境，2004，13(2)：156-167.

[53]魏樹和，周啟星，王 新，等. 某鉛鋅礦坑口周圍具有重金屬超積累特征植物的研究[J]. 環境污染治理技術與設備，2004，5(3)：33-39.

[54]周建軍，周 桔，馮仁國. 我國土壤重金屬污染現狀及治理戰略[J]. 中國科學院院刊，2014，29(3)：315-320.

[55]Sayler G S，Ripp S. Field applications of genetically engineered microorganisms for bioremediation processes[J]. Current Opinion in Biotechnology，2000，11(3)：286-289.

[56]Verma N，Singh M. Biosensors for heavy metals[J]. Biometals，2005，18(2)：121-129.

[57]Bruschi M，Goulhen F. New bioremediation technologies to remove heavy metals and radionuclides using Fe (Ⅲ)-，sulfate-and sulfur-reducing bacteria[M]. Springer Berlin Heidelberg：Environmental Bioremediation Technologies，2007：35-55.

[58]Divya B，Kumar M D. Plant-microbe interaction with enhanced bioremediation[J]. Research Journal of Biotechnology，2011，6(4)：72-79.

[59]Kostal J，Yang R，Wu C H，et al. Enhanced arsenic accumulation in engineered bacterial cells expressing ArsR[J]. Applied and Environmental Microbiology，2004，70(8)：4582-4587.

[60]Kang S H，Singh S，Kim J Y，et al. Bacteria metabolically engineered for enhanced phytochelatin production and cadmium accumulation[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73(19)：6317-6320.

[61]Hasin A A，Gurman S J，Murphy L M，et al. Remediation of chromium(Ⅵ) by a methane-oxidizing bacterium[J]. Environmental Science & Technology，2009，44(1)：400-405.

[62]Ackerley D F，Gonzalez C F，Keyhan M，et al. Mechanism of chromate reduction by theEscherichiacoliprotein，NfsA，and the role of different chromate reductases in minimizing oxidative stress during chromate reduction[J]. Environmental Microbiology，2004，6(8)：851-860.

[63]Valls M，Atrian S，de Lorenzo V，et al. Engineering a mouse metallothionein on the cell surface ofRalstoniaeutrophaCH34 for immobilization of heavy metals in soil[J]. Nat Biotechnol，2000，18(6)：661-665.

[64]Brim H，McFarlan S C，Fredrickson J K，et al. Engineering deinococcus radiodurans for metal remediation in radioactive mixed waste environments[J]. Nature Biotechnology，2000，18(1)：85-90.

[65]Murtaza I，Dutt A，Ali A. Biomolecular engineering ofEscherichiacoliorgano-mercurial lyase gene and its expression[J]. Indian Journal of Biotechnology，2002，1(1)：117-120.

[66]Zhao X W，Zhou M H，Li Q B，et al. Simultaneous mercury bioaccumulation and cell propagation by genetically engineeredEscherichiacoli[J]. Process Biochemistry，2005，40(5)：1611-1616.

[67]Kiyono M，Pan-Hou H. Genetic engineering of bacteria for environmental remediation of mercury[J]. Journal of Health Science，2006，52(3)：199-204.

[68]Mrinal B，Palombo E A，Belinda D，et al. A Tn5051-like mer-containing transposon identified in a heavy metal tolerant strainAchromobactersp. AO22[J]. Bmc Research Notes，2009，2(1)：1-7.

[69]López A，Lázaro N，Morales S，et al. Nickel biosorption by free and immobilized cells ofPseudomonasfluorescens，4F39：a comparative study[J]. Water Air & Soil Pollution，2002，135(1/2/3/4)：157-172.

[70]Sriprang R，Hayashi M，Ono H，et al. Enhanced accumulation of Cd2+by aMesorhizobiumsp. transformed with a gene fromArabidopsisthalianacoding for phytochelatin synthase.[J]. Appl Environ Microbiol，2003，69(3)：1791-1796.

[71]賈昌梅，牛顯春，鐘華文，等. 珠江三角洲濕地污泥重金屬污染特征及風險評價[J]. 江蘇農業科學，2016，44(5)：442-447.

[72]郭李凱，任珊珊，畢 斌，等. 煤矸山下農田土壤重金屬的空間分布及生態風險評價[J]. 江蘇農業科學，2016，44(8)：467-470.

[73]周啟星，魏樹和，刁春燕. 污染土壤生態修復基本原理及研究進展[J]. 農業環境科學學報，2007，26(2)：419-424.