FSH-β、PRLR和FUT1基因多態性與母豬繁殖性狀的關聯性分析

李夢尋， 胡九英， 孫敬禮， 魯慧文， 汪德明， 王 忻， 劉 乙， 馬力鵬， 李 濤， 沈永巧， 來紅霞， 黃 濤

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000； 2.新疆正大食品有限公司，新疆五家渠 831301)

豬的繁殖性能是重要經濟性狀，但遺傳力低，利用常規育種對該性狀進行遺傳改良進展緩慢。利用影響產仔性能的主效基因進行分子標記輔助育種是加快母豬繁殖性狀遺傳進展的有效途徑。

FSH-β是促卵泡素β基因。促卵泡素(FSH)是哺乳動物卵子和精子成熟的主要刺激物，是α/β異二聚體糖蛋白激素家族的成員。α和β二亞基非共價連接，β亞基決定著每種激素的生理特征[1]。FSH能誘導雌性動物的卵泡發育、促進子宮內膜生長等，FSH還協同促黃體生成素(LH)一起刺激性腺類固醇、雌二醇和孕酮的合成和分泌，而這些固醇類物質又可以直接或間接地調控FSH的合成[2]。FSH在畜牧業生產中用于家畜的同期發情和超數排卵等[3]。有研究認為FSH-β基因可作為遺傳學中有關繁殖性狀研究的重要分子標記，基因中的1處逆轉座子插入突變產生AA、AB、BB 3種基因型[4]。

催乳素受體(PRLR)是細胞分裂素受體超家族，是一個單獨的膜被蛋白[5]。PRLR的缺失會影響催乳素蛋白的作用，使催乳素不能與之結合，進而不能通過受體作用于靶細胞而引起靶基因的表達。PRLR基因的突變可以提高窩產子數和窩產活子數，降低木乃伊率，PRLR基因的敲除會引起動物的繁殖障礙疾病[6]。目前，PRLR基因的作用引起了豬育種研究者的重視，并把它作為繁殖性狀的候選基因之一。

FUT1基因位于6號染色體上，是編碼α-(1，2)巖藻糖轉移酶的基因，多數研究發現其與豬腹瀉有關，但近年來也有研究證明FUT1與母豬繁殖性狀有關。

母豬繁殖性狀是數量性狀，遺傳力低。遺傳、季節、胎次和周圍環境等因素都能對其造成影響。FSH-β、PRLR和FUT1基因與豬繁殖性能有密切關聯，但由于試驗群體和樣本量不同，研究結果各有差異。此外多項研究發現，單個候選基因的優勢等位基因和基因型對母豬繁殖性狀的影響不顯著，而多個候選基因合并基因型對母豬繁殖性狀的影響有顯著差異。本研究檢測了大白豬FSH-β、PRLR和FUT1基因多態性，并分析其單個基因的基因型和合并基因型與豬繁殖性狀之間的關系，以便為大白豬分子標記輔助選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選用的269頭大白母豬均來自新疆正大種豬場。采集耳組織樣本，放入含1 mL 75%乙醇的Eppendoff管內，放入冰盒帶回實驗室，-20 ℃保存，以備后面的樣本組織DNA提取。此外搜集整理了樣本群體第二胎的總產仔數、產活仔數、健子數、窩質量、初生體質量、死胎、木乃伊、弱仔和畸形等繁殖性狀相關資料。

1.2 試驗試劑

2×EsTaqMaster Mix，購自CWBIO公司；Marker DL2000、血液、細胞、組織基因組DNA抽提試劑盒，均購自TIANGEN公司；限制性內切酶AluⅠ、HhaⅠ，購自TaKaRa公司。

1.3 引物設計與合成

FSH-β、PRLR和FUT1基因PCR擴增引物參照施啟順等的引物序列[7-8]，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.4 豬耳組織DNA提取

用血液、細胞、組織基因組DNA抽提試劑盒對所采集母豬耳組織樣進行基因組DNA提取并檢測其濃度，-20 ℃保存備用。

1.5 PCR擴增與多態性檢測

1.5.1 PCR擴增 PCR反應體系15.0 μL：2×EsTaqMaster Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，去離子水6.2 μL。PCR反應條件：94 ℃變性4 min，35次循環(94 ℃，30 s；56、60、57 ℃，30 s；72 ℃，30 s)，72 ℃延伸 5 min。所有基因PCR產物經2%瓊脂糖凝膠檢測后方可進行下一步反應。

1.5.2 基因型檢測FSH-β基因由片段插入造成，2.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產物即可見多態性。PRLR基因酶切反應：13.0 μL PCR產物、0.5 μL AluⅠ及1.5 μL Buffer，37 ℃水浴4 h，反應結束后取酶切產物10.0 μL用4.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分型。FUT1基因酶切反應：8.5 μL PCR產物、0.5 μL HhaⅠ和1.0 μL Buffer，37 ℃水浴3 h，酶切產物 10 μL 用2.0%的瓊脂糖電泳檢測分型。

1.6 數據整理與統計分析

用Excel表格計算基因頻率、基因型頻率、多態信息含量、有效等位基因數、群體雜合度，并對基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗[9]，用SPSS 17.0分析總產仔數、產活仔數、健仔數等繁殖性狀在不同基因型之間的差異。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增及酶切結果

FSH-β基因由片段插入得到，瓊脂糖電泳檢測PCR產物即可見多態性，PCR產物經2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，產生3種帶型：500 bp純合子(AA基因型)；500、220 bp雜合子(AB基因型)；220 bp純合子(BB基因型)。

PRLR基因PCR產物經限制性內切酶AluⅠ酶切后，產生3種帶型：85、59、19 bp的命名為AA基因型；104、85、59、19 bp 的命名為AB基因型；104、59 bp的命名為BB基因型。

FUT1基因PCR產物經限制性內切酶HhaⅠ酶切后經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測到3種帶型：328、93 bp的命名為AA基因型；328、241、93、87 bp的命名為AB基因型；241、93、87 bp的命名為BB基因型。

2.2 各基因型頻率、基因頻率及群體遺傳特性

2.2.1 各基因型頻率、基因頻率 由表2可知，FSH-β基因型頻率在大白豬為AB>BB>AA，優勢基因均為B等位基因優勢。PRLR基因型頻率在大白豬為AB>AA>BB，優勢基因均為A基因。FUT1基因型頻率在大白豬為BB>AB>AA，優勢基因均為B基因。

表2 FSH-β、PRLR和FUT1基因的基因型頻率及等位基因頻率

2.2.2 不同基因的群體遺傳特性 由表3可知，FSH-β、PRLR和FUT1基因在試驗群體中具有中度多態(0.25

表3 基因多態信息含量(PIC)、雜合度(H)、有效等位基因數(Ne)及χ2檢驗

注：df=2，P=0.05時χ2=5.99，P=0.01時χ2=9.21。

2.3 基因多態性與豬繁殖性狀的關聯分析

2.3.1 單個基因多態性與豬繁殖性狀的關聯分析FSH-β基因各基因型間母豬繁殖性狀上均無顯著差異，因此表中并未列出。由表4可知，對于PRLR基因，AA、AB型個體總產仔數分別比BB型個體高出2.07頭/胎(P<0.05)和1.30頭/胎(P<0.05)，各基因型間其他繁殖性狀上均無顯著差異。對于FUT1基因，AA型個體弱仔數分別比BB、AB型少1.24頭/胎(P<0.05)和1.02頭/胎(P<0.05)，AA型個體畸形胎兒數比AB、BB型個體高0.72頭/胎(P<0.01)和0.71頭/胎(P<0.01)，其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

2.3.2 合并基因型與豬繁殖性狀的關聯分析

2.3.2.1FSH-β與PRLR合并基因型與母豬繁殖性狀的關聯分析 由表5可知，在總產仔數、總活仔數性狀上FSH-β—PRLR合并基因AAAA型個體比AABB型高出4.6頭/胎(P<0.01)和3.9頭/胎(P<0.01)；在窩質量性狀上，AAAA型個體高于AABB型5.4 kg/胎(P<0.05)。因此，在大白豬中FSH-β-PRLR最優分子標記組合為AAAA。

表4 PRLR和FUT1基因多態性與母豬繁殖性狀的關聯分析

注：同列小寫字母、大寫字母不同者分別為差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。下表同。

表5 FSH-β和PRLR合并基因型與大白豬繁殖性狀的關聯分析

聯分析 由表6可知，在大白豬中FSH-β—FUT1的ABAB型個體木乃伊胎數量比BBBB型多0.28頭/胎(P<0.05)；在子代畸形數量上BBAA型個體多于其他基因型(P<0.01)；在其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

表6 FSH-β和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關聯分析

2.3.2.3PRLR與FUT1合并基因型與母豬繁殖性狀的關聯分析 由表7可知，在大白豬中，PRLR—FUT1合并基因型BBAB型個體木乃伊胎數量多于其他各基因型(P<0.01)，ABAA、BBBB型低于AAAB、AABB、ABAB、ABBB型(P<0.01)；在其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

表7 PRLR和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關聯分析

2.3.2.4FSH-β、PRLR與FUT1合并基因型與母豬繁殖性狀的關聯分析 由表8可知，在大白豬中由于FSH-β—PRLR—FUT1中AAAAAB和AABBAB型個體的數量少于3頭，因此這2種基因型不參與多重比較。FSH-β—PRLR—FUT1 BBAABB型個體的總產仔數和活仔數分別比BBABAB型多3.20頭(P<0.01)、2.98頭(P<0.05)。因此，在大白豬中FSH-β—PRLR—FUT1最優分子標記組合為BBAABB。

3 結果與討論

FSH-β是母豬繁殖性狀的一個主效基因。研究表明B等位基因為優勢基因，初產母豬FSH-β基因的AB基因型健仔數比AA型多1.21頭(P<0.01)，經產母豬各基因型之間產仔數差異不顯著[9]。在趙要風等的研究中，杜洛克、大約克、長白等國外豬種中BB型為FSH-β的優良基因型，AA型比較罕見[10]。而Korwin-Kossakowska等研究結果發現，FSH-β對產仔數的提高無顯著影響[11-12]。本研究所用經產大白豬群體優勢基因均為B等位基因，優良基因型為BB型，FSH-β的不同基因型對不同繁殖性狀的影響均不顯著，這表明單個基因FSH-β對經產母豬的繁殖性狀的選擇不具有顯著意義。

PRLR也是母豬繁殖性狀的主效基因之一，由腺垂體分泌，含有膜外結構域、跨膜域和胞內域3個部分，胞內域的變異導致了受體結構的多樣性[13-14]。王立辛等報道了PRLR基因在長白、大白和杜洛克群中基因頻率及基因型頻率情況，長白群中AB的基因型頻率最高，杜洛克群中AA的基因型頻率最高，A等位基因在各種群中占主導地位[15]。Isler等研究，PRLR基因對AA、AB和BB型的母豬的子宮角胎兒的平均數都有影響，并呈現出AA型>AB型>BB型，其中B型基因是有利基因[16]。本研究中大白豬群體中A等位基因為優勢基因，AB型為優勢基因型，AA、AB型個體的總產仔數多于BB型個體，這表示A基因為大白豬總產仔性狀的正效基因，對PRLR基因的A基因進行合理地選擇，可能會有效提高大白豬的總產仔數，以提高母豬生產效應。

表8 FSH-β、PRLR和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關聯分析

FUT1是一種巖藻糖轉移酶，FUT1基因位于豬的6號染色體上，多數研究發現其與仔豬腹瀉有關，但證明FUT1與母豬繁殖形狀的研究很少。吳圣龍對蘇太豬基因位點各基因型的生產性能比較研究結果表明，AB基因型的個體平均生產性能高于基因型BB的個體，AB基因型的個體胎斷奶窩質量、胎總產仔數和胎斷奶窩質量均顯著高于BB基因型的個體[17]。在本研究的大白豬群體中，等位基因B為優勢基因，BB型為優勢基因型。在大白豬中AA型個體的弱仔數顯著低于AB、BB，而胎兒的畸形數卻極顯著高于AB、BB，其他繁殖性狀的各基因型間差異均不顯著，這或許可以說明A基因為大白豬弱仔和胎兒畸形性狀的負效基因，對FUT1基因的A等位基因進行合理選擇，可能會有效減少大白豬產弱仔和畸形胎兒的數量，以提高母豬活仔、健仔數的產出。

合并基因型分析結果表明，合并基因型的遺傳效應高于單個基因型的遺傳效應[18]。在大白豬中FSH-β—PRLR不同合并基因型在總產仔數、總活仔數、窩質量、出生體質量、死胎性狀上不同的基因型皆有顯著性差異。FSH-β—FUT1在大白豬的ABAB型個體的木乃伊胎數比BBBB型高；BBAA型個體的胎兒畸形數多于AAAB、AABB、ABAB、ABBB、BBAB、BBBB型。PRLR-FUT1在大白豬的木乃伊胎性狀上BBAB型極顯著高于其他各基因型。FSH-β—PRLR—FUT1在大白豬的總產仔數、總活仔數、死胎、木乃伊胎、窩質量、出生體質量性狀上不同基因型皆有一定的差異性。

本研究分析發現，大白豬繁殖性狀FSH-β—PRLR最優分子標記組合為AAAA，FSH-β—PRLR—FUT1最優分子標記組合BBAABB。這提示在種豬繁殖性狀的選育過程中，應根據豬群特征有目的地選擇2個或多個影響繁殖性能的候選基因進行合并，并結合分子標記輔助育種方法來進一步有效地改善母豬的繁殖性狀。

參考文獻：

[1]Pierce J G，Parsons T F. Glycoprotein hormones：structure and function[J]. Annual Review of Biochemistry，1981，50：465-495.

[2]Phillips C L，Lin L W，Wu J C，et al. 17 Beta-estradiol and progesterone inhibit transcription of the genes encoding the subunits of ovine follicle-stimulating hormone[J]. Molecular Endocrinology，1988，2(7)：641-649.

[3]Fen G，Dong P，Shi Y H. Study on the production of bovine FSH by biological techniques[J]. Science in China(Series B)，1995，25(6)：604-609.

[4]鄭心力，劉海隆，黃麗麗，等. 五指山豬FSHβ基因克隆測序及生物信息學分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2016(9)：93-95.

[5]Bazan J F. Haemopoietic receptors and helical cytokines[J]. Immunology Today，1990，11(10)：350-354.

[6]儲明星. 豬產仔性狀候選基因的研究進展[J]. 畜牧與獸醫，2001，33(1)：36-37.

[7]施啟順，柳小春，劉志偉. 5個與豬產仔數相關基因的效應分析[J]. 遺傳，2006，28(6)：652-658.

[8]Knoll A，Stratil A，Cepica S，et al. Length polymorphism in an intron of the porcine osteopontin (SPP1) gene is caused by the presence or absence of a SINE (PRE-1) element[J]. Animal Genetics，1999，30(6)：466.

[9]劉 超，沈君葉，朱士恩，等.FSH-β、ESR、BF基因對大白豬繁殖性狀的遺傳效應分析[J]. 中國畜牧雜志，2013(17)：6-11.

[10]趙要風，李 寧，肖 璐，等. 豬FSH-β亞基基因結構區逆轉座子插入突變及其與豬產仔數關系的研究[J]. 中國科學(C輯)，1999，29(1)：81-86.

[11]Korwin-Kossakowska A，Kamyczek M，Cielak D，et al. The effect of the polymorphism of leptin(LEP)，leptin receptor(LEPR)and osteopontinOPN genes on selected reproduction traits of synthetic Line 990 sows[J]. Anim Sci Papers and Reports，2002，20(3)：159-168.

[12]Linville R C，Pomp D，Johnson R K，et al. Candidate gene analysis

for loci affecting litter size and ovulation rate in swine[J]. Journal of Animal Science，2001，79(1)：60-67.

[13]Bazan J F. Haemopoietic receptors and helical cytokines[J]. Immunology Today，1990(10)：350-354.

[14]Wells J A，de Vos A M. Hematopoietic receptor complexes[J]. Annual Review of Biochemistry，1996，65(1)：609-634.

[15]王立辛，蘇玉虹，高繼紅. 豬ESR、FSH-β和PRLR基因合并基因型對產仔數的影響[J]. 中國農學通報，2011，27(29)：18-22.

[16]Isler B J，Irvin K M，Neal S M，et al. Examination of the relationship between the estrogen receptor gene and reproductive traits in swine[J]. Journal of Animal Science，2002，80(9)：2334-2339.

[17]吳圣龍. 豬FUT1和SLA-DQB基因多態性及抗病育種基礎研究[D]. 揚州：揚州大學，2006.

[18]李盛霖，林長光，朱志明，等. 大白、長白及其雜交母豬FSH-β基因多態性與繁殖性狀的相關分析[J]. 福建農業學報，2006，21(4)：330-333.