解淀粉芽孢桿菌所產脂肽豐原素是防治蘋果采后青霉病的關鍵物質

付瑞敏， 常慧萍， 邢文會， 陳五嶺

(1.河南教育學院生命科學系，河南鄭州 450046； 2.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069)

通信作者：陳五嶺，碩士，教授，博士生導師，主要從事農業、環境及食品微生物研究。E-mail：angelaminmin@163.com。

蘋果青霉病是蘋果采后最為常發的病害，其致病菌是擴展青霉菌(Penicilliumexpansum)[1]。由于在果實的貯藏時期或運輸途中，不可避免會造成果實相互之間的碰撞而導致機械損傷，此時原本潛伏于果實表面的擴展青霉菌孢子會從傷口入侵果實，產生菌絲體，不僅會引起果實腐爛，其次級代謝產物展青霉素還會危害人體健康，造成極為嚴重的食品安全問題[2]。通常采用噴灑克霉凈、氟硅唑等化學殺菌劑防治蘋果采后青霉病，這種方法具有見效快、效果好等優點，但長期使用易使病菌產生抗藥性，并危害食品安全，污染環境。隨著人們環保意識的不斷增強，越來越多的生物農藥被用于植物病害的防治中[3-4]。其中，芽孢桿菌以其對環境的高度耐受性和產生各種多肽類、脂肽類和細菌素等抑菌性物質的特點，成為當前生物農藥的研究熱點。解淀粉芽孢桿菌可以產生多種抗生素，其中，通過非核糖體多肽合成酶合成的分子量小于2 000 u的脂肽類抗生素發揮重要的抗菌作用。根據其氨基酸構型不同，將解淀粉芽孢桿菌所產的脂肽抗生素分為表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、豐原素(fengycin)等3個家族。豐原素、伊枯草菌素具有極強的抗真菌活性，特別是豐原素，可以顯著抑制絲狀真菌的生長。表面活性素具有很強的表面活性，其乳化和發泡能力都很強，可以有效降低液體表面的張力。此外，表面活性素還有溶血、抗病毒、抗細菌等生物學活性[5-7]。由于具有重要的生物活性，很多脂肽已從芽孢桿菌的菌株中得以分離和鑒定，并從遺傳水平闡明了其生物功能。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-16-8是筆者所在實驗室前期分離選育的，可以有效抑制擴展青霉的拮抗菌[8]。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，簡稱MALDI-TOF-MS)分析該菌的代謝產物，發現該菌株可以產豐原素、表面活性素等2類脂肽抗生素。通過檢測這2種物質拮抗擴展青霉菌的性能，發現豐原素是解淀粉芽孢桿菌BA-16-8抑制擴展青霉菌的主要物質。為進一步驗證這一結論，本研究采用分子遺傳學技術，通過構建解淀粉芽孢桿菌BA-16-8的豐原素缺失突變體并結合抑菌試驗和果實生防試驗，以證實豐原素在解淀粉芽孢桿菌抑制擴展青霉菌中所起的作用，從而為探討解淀粉芽孢桿菌的抑菌機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質粒 試驗所用菌株、質粒的詳細信息如表1所示。

1.1.2 主要試劑 試驗所用試劑的詳細信息如表2所示。

1.1.3 試驗儀器 Agilnt 1100series高效液相色譜系統，購自美國安捷倫公司；液相色譜-電噴霧質譜儀由Waters Alliance2690高效液相色譜儀(購自美國Waters公司)和TSQ Quantum Discovery三級四極桿質譜儀(購自美國Thermo Fisher Scientific公司)組成。

表1 試驗所用菌株及質粒

表2 主要試劑及廠家

1.1.4 引物 本試驗所用來擴增解淀粉芽孢桿菌的fenC基因(7 647 bp)上下游臂的引物根據NCBI上的解淀粉芽孢桿菌Q426菌株基因組序列設計，抗性基因spc的引物根據質粒PUS19設計，設計工作由Primer premier 5.0軟件完成，具體信息如表3所示，引物合成及序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表3 試驗所用引物的信息

注：引物序列下劃線是限制性酶切位點，用于基因連接。

1.1.5 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基(BEP)的具體配方參照文獻[9]，BEPA為固體培養基，BEPB為液體培養基，該培養基主要用于拮抗菌的培養。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)及馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)的具體配方參照文獻[9]，該培養基主要用于病原菌的培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌豐原素基因的生物信息學分析 根據解淀粉芽孢桿菌Q426全基因組序列(JQ271536)，找到豐原素基因fenC及其編碼的蛋白序列，采用Blast在線軟件對編碼蛋白豐原素合成酶C的同源性及蛋白功能域進行分析。

1.2.2 穿梭質粒pMAD構建缺失突變株BA-16-8Δfen

1.2.2.1 突變載體的構建 采用基因組DNA提取試劑盒提取解淀粉芽孢桿菌BA-16-8的基因組DNA，以其為模板以P1、P2為引物擴增fenC上游片段。擴增片段長度約為 1 844 bp，將其作為上游同源臂；以P3、P4為引物擴增下游片段，擴增長度約為1 645 bp，將其作為下游同源臂。參照文獻[10-12]，以質粒PUS19序列為模板，設計壯觀霉素抗性基因的引物P5、P6，并擴增壯觀霉素抗性基因spc，擴增長度約為 1 146 bp，將PCR擴增所得到的產物經限制性內切酶酶切后用瓊脂糖凝膠電泳回收，連入pMAD質粒的相關限制性酶切位點，將其轉入大腸桿菌(E.coli)DH5α，經篩選最終獲得pMAD-ΔfenC，將其進行測序分析，并驗證所構建突變體序列的正確性，同源重組過程如圖1所示。

1.2.2.2 突變子的篩選 所得pMAD-ΔfenC突變子經測序驗證其正確性后，參照Arnuad的方法[12]，采用電轉化法(條件為電壓2 kV，電容25 μF，電阻100 Ω)將其轉入解淀粉芽孢桿菌BA-16-8中，并篩選fenC基因缺失突變體。pMAD是溫度敏感型穿梭質粒，可同時在大腸桿菌和芽孢桿菌中復制，該質粒中含有用來編碼β-半乳糖苷酶的LacZ基因，它可以分解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)產生藍色菌落。此外，質粒中存在溫度敏感復制子，當溫度低于30 ℃時，該質粒可以穩定存在于革蘭氏陽性菌的細胞中，質粒上所攜帶的基因可以通過菌株染色體上的同源序列進行交換甚至雙交換；而當溫度升高至40 ℃及以上時，該質粒就容易丟失，因此，陽性突變子的篩選先經過30 ℃的基因交換，再經過40 ℃的質粒丟失。

當基因敲除突載體pMAD-Δfen轉入感受態細胞大腸桿菌DH5α后，將其涂布于含有100 μg/mL X-gal的BEP平板，30 ℃培養24 h，此時pMAD-Δfen或是游離在細胞中或是發生了單交換，感受態細胞可以表達LacZ基因，因此平板上長出的藍色菌落就是轉化成功的轉化子。

將選出的藍色菌落轉接入解淀粉芽孢桿菌BA-16-8的液體培養基中，42 ℃、180 r/min搖床振蕩培養24 h；將培養菌液轉接至新鮮的含50 μg/mL壯觀霉素的BEP液體培養基中，42 ℃、180 r/min搖床振蕩培養12 h；將溫度降至30 ℃，180 r/min繼續搖床振蕩培養12 h。將培養菌液轉接至含有100 μg/mL X-gal和50 μg/mL壯觀霉素的BEP平板中，30 ℃ 培養24 h，選取白色菌落分別接于含3 μg/mL紅霉素的BEP平板上，挑選紅霉素敏感菌株，即為構建的fenC基因缺失突變的突變菌株，為BA-16-8Δfen菌株。

1.2.2.3 突變子的鑒定 以BA-16-8Δfen菌株為模板，分別以P1/P4、P7/P8為引物進行PCR擴增，并以BA-16-8菌株為陰性對照，把所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，比對目的條帶的大小是否與預測的大小一致，若一致，則說明spc基因成功替代了fenC基因，即構建突變子成功，反之，則不成功。最后，將PCR擴增產物回收并進行測序驗證。

1.2.3 野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen的HPLC分析

1.2.3.1 菌株代謝產物脂肽粗提液的制備 將培養24 h的野生菌株和突變菌株的菌體發酵液于常溫下8 000 r/min離心 20 min，棄沉淀，將所得上清液置于無菌錐形瓶中，用 7 mol/L HCl溶液將其pH值調為2.0，無菌條件下分裝至 10 mL 的無菌離心管中(每管10 mL)，4 ℃過夜，10 000 r/min離心20 min，取沉淀，在沉淀中加入0.5 mL中性甲醇溶液，以此方法操作2次，將所得萃取液合并，并將其濃縮至5倍濃度，經0.2 μm濾膜過濾后即為菌株代謝產物的脂肽粗提液。

1.2.3.2 HPLC分離純化脂肽類抗生素 本試驗檢測波長為280 nm，柱子溫度為30 ℃，進樣量為10 μL，等梯度洗脫進行樣品分析，洗脫條件如表4所示，手動收集各組分，將收集液經旋轉蒸發儀濃縮待用。

表4 高效液相色譜洗脫條件

1.2.3.3 野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen對擴展青霉菌抑制活性的檢測 取野生菌株和突變菌株經HPLC分離純化的濃縮液各200 μL，采用牛津杯法檢測野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen的脂肽拮抗擴展青霉菌的能力，培養溫度為28 ℃，培養時間為5 d，測量并記錄牛津杯周圍出現的抑菌圈直徑，以無菌水作為對照，每個處理重復3次。

1.2.4 野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen對蘋果青霉病的防效測定

1.2.4.1 擴展青霉菌孢子液的制備 參照文獻[13]，制備擴展青霉菌孢子液。

1.2.4.2 防效測定 采用果實生防試驗[14-15]，對野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen防治蘋果青霉病的效果進行測定。試驗樣本為100個紅富士蘋果，所選蘋果大小及成熟度均一致。將蘋果經75%乙醇消毒并經清水洗凈后，用無菌打孔器在每個蘋果表面打孔，孔徑6 mm，孔深5 mm。試驗共分為5組：處理1為10 μL野生菌株BA-16-8菌懸液+10 μL 擴展青霉菌孢子液，處理2為10 μL 野生菌株BA-16-8脂肽粗提液+10 μL 擴展青霉菌孢子液，處理3為10 μL 突變菌株BA-16-8Δfen菌懸液+10 μL 擴展青霉菌孢子液，處理4為10 μL 突變菌株BA-16-8Δfen脂肽粗提液+10 μL 擴展青霉菌孢子液，處理5(對照)為10 μL無菌水+10 μL擴展青霉菌孢子液。將各組處理液分別加于蘋果的孔洞中，每個處理重復20次。將處理后的蘋果分別裝入培養箱中，溫度為28 ℃，濕度為95%，96 h后觀察蘋果的染病情況，并統計菌絲生長情況。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌的豐原素合成酶生物信息學分析

通過對解淀粉芽孢桿菌Q426菌株全基因組序列(JQ271536)分析，發現Q426的豐原素合成酶基因簇序列與解淀粉芽孢桿菌DSM7菌株(FN597644)的豐原素合成酶基因序列的同源性高達96%，與解淀粉芽孢桿菌Y2菌株(NC17912)的同源性達93%，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)168的豐原素合成酶操縱子(AL009126)序列的同源性為88%。豐原素操縱子包含5個開放閱讀框，它們分別是fenC、fenD、fenE、fenA、fenB，這5個操縱子分別編碼合成酶的5個單體酶，即FenC、FenD、FenE、FenA、FenB[16]。

2.2 解淀粉芽孢桿菌BA-16-8 fenC基因缺失突變子的構建篩選

2.2.1fenC基因缺失突變載體pMAD-Δfen的構建 根據NCBI上已知菌株解淀粉芽孢桿菌Q426的第1個豐原素合成酶操縱子fenC基因的上下游序列，設計出4條引物，并以解淀粉芽孢桿菌BA-16-8菌株的基因組為模板，對fenC的上游序列(上游臂)和下游序列(下游臂)進行擴增。測序結果表明，PCR擴增分別獲得長度約為1 844 bp的上游序列、1 645 bp 的下游序列。為構建缺失突變載體，選用壯觀霉素抗性基因spc取代fenC基因，通過設計spc基因的引物并進行PCR擴增，得到1條大小為1 146 bp的條帶，將PCR擴增得到的這3個條帶分別用限制性內切酶酶切，并用連接酶逐一按上游臂、spc、下游臂的順序連接至pMAD載體上，構建fenC基因缺失突變載體pMAD-Δfen。分別以pMAD-Δfen、pMAD為模板，以P1/P2、P3/P4、P5/P6為引物對載體進行PCR鑒定，結果顯示，以pMAD-Δfen為模板的PCR產物中有上游臂、下游臂和spc抗性基因，而以pMAD為模板的PCR產物中沒有，說明構建載體成功。

2.2.2 菌株BA-16-8的fenC基因缺失突變體BA-16-8-Δfen的構建與鑒定 參照Arnuad的方法[12]，采用電轉化法將其轉入解淀粉芽孢桿菌BA-16-8中，經過抗生素篩選和藍白斑篩選，挑選陽性菌株，對其進行質粒提取和酶切鑒定，經30 ℃雙交換及高溫質粒丟失，最終篩選出fenC基因缺失突變體。為鑒定突變子的構建是否成功，以BA-16-8Δfen菌株為模板，以P1/P4、P7/P8為引物，分別進行PCR擴增，并以BA-16-8菌株為陰性對照，所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖2可知，采用引物P1/P4，在BA-16-8菌株上得到大小約為11 kb(up-fenC-down)的片段，在BA-16-8ΔfenC菌株上得到大小約為4.6 kb(up-spc-down)的片段；采用引物P7/P8，在BA-16-8菌株上得到大小約為 7.6 kb(fenC)的片段，在BA-16-8Δfen菌株上沒有擴增出片段。上述結果初步表明，突變菌株BA-16-8Δfen的fenC基因已經被敲除，將PCR產物純化并測序， 所得結果進一步證實

了BA-16-8菌株中的fenC基因已經被spc基因所替代。

2.3 解淀粉芽孢桿菌BA-16-8野生型及突變子的HPLC分析結果

對野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen的粗提液進行HPLC分離純化。由圖3可知，野生菌株BA-16-8主要分離出2組物質，a物質的保留時間為 21.360 min，b物質的保留時間為41.260 min；突變菌株BA-16-8Δfen主要分離出1組物質，其保留時間為21.370 min。對照同一洗脫條件下的表面活性素、豐原素標樣，推測野生菌株BA-16-8中分離出的物質為表面活性素、豐原素，突變菌株BA-16-8Δfen中分離出的物質為豐原素。

將HPLC分離純化出的物質分別經收集、濃縮并定容至1 mL，用牛津杯法檢測各片段的抑菌活性。由表5可知，只有b物質有明顯的拮抗活性。與野生株相比，失去了豐原素合成能力的突變株抑制擴展青霉菌的能力顯著下降，它的無細胞發酵液幾乎喪失了抑菌性能。

表5 野生菌株及突變子的脂肽蛋白抗擴展青霉菌效果

2.4 解淀粉芽孢桿菌BA-16-8野生型及突變子脂肽類產物質譜分析結果

BA-16-8經飛行時間質譜檢測分析，獲得了粗提液中各脂肽的相對分子質量，所得質譜圖如圖4所示，所得分析結果如表6所示。圖4-a中有2個系列的離子峰，結合表6中的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+離子分析結果，可知它們分別為表面活性素、豐原素家族的同系物。圖4-b中只有1個系列的離子峰，結合表6中的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+離子分析結果，可知它們是表面活性素家族的同系物。將質譜分析結果、PCR檢測結果和HPLC結果結合起來可知，野生菌株BA-16-8的發酵液中提取的抗菌性脂肽為豐原素、表面活性素，而突變子BA-16-8Δfen的發酵液中提取的抗菌性脂肽為表面活性素，這說明突變子沒有產生豐原素，說明fenC基因缺失突變子構建成功。綜合HPLC、MS和抑菌性能分析結果，可以確定豐原素在BA-16-8菌株抑制擴展青霉菌的過程中發揮著關鍵作用。

2.5 野生菌株BA-16-8和突變菌株BA-16-8Δfen對蘋果青霉病的防效測定

由表7可知，96 h后，野生菌株BA-16-8的菌懸液及無細胞發酵液均可以對擴展青霉菌在蘋果表面的生長產生較

表6 野生菌株及突變子的質譜分析結果

強的抑制作用。然而被敲除了fenC基因的突變菌株 BA-16-8Δfen的防治效果明顯低于野生菌株，特別是突變菌株BA-16-8Δfen的無細胞發酵液處理組，其病斑直徑幾乎和對照一致，這表明野生菌株BA-16-8的菌株細胞和脂肽提取物可以較好地防治蘋果采后青霉病，而突變子BA-16-8Δfen在喪失了豐原素合成能力之后，對青霉病的防治能力也顯著降低，該結論再次表明了解淀粉芽孢桿菌 BA-16-8 拮抗擴展青霉菌病原菌及防治青霉病的主要物質是豐原素。

表7 不同處理對蘋果青霉病的抑制效果

3 結論與討論

芽孢桿菌屬是重要的生防菌，其模式菌株是枯草芽孢桿菌，而解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌的親緣關系極為接近，同枯草芽孢桿菌一樣，它也可以表達多種抗菌性多肽，包括核糖體合成途徑合成肽和非核糖體合成途徑合成肽[17]。這些多肽或是協同或是獨立發揮著抑制病原菌的作用。

針對蘋果采摘后青霉病的生物防治，筆者所在實驗室前期選育出1株可以高效抑制青霉病致病菌擴展青霉菌的解淀粉芽孢桿菌BA-16-8，通過分離純化該菌株的抑菌活性物質并對比其抑菌活性，了解到豐原素對擴展青霉菌的抑制效果顯著高于表面活性素，因此，推測豐原素可能是解淀粉芽孢桿菌抑制擴展青霉菌的主要物質。為證實該推測，本研究以菌株BA-16-8為試驗對象，根據同源重組原理，借助溫度敏感型質粒pMAD構建了1個豐原素合成酶基因功能缺陷突變菌株BA-16-8Δfen，經PCR擴增、電泳分析及序列測定，最終確定fenC基因被成功敲除。通過檢測突變菌株和野生菌株所產脂肽蛋白體內和體外的抑菌活性，結果顯示，解淀粉芽孢桿菌的突變子BA-16-8Δfen不僅喪失了合成豐原素的能力，也失去了抑制擴展青霉菌和防治蘋果青霉病的能力，因此確定抑制擴展青霉菌的主要物質是豐原素。

報道顯示，豐原素可以抑制多種植物病原菌特別是絲狀真菌[18]，但其具體作用機制仍是眾說紛紜。Tanaka等的研究表明，豐原素可以破壞細菌胞膜的結構及滲透性，豐原素可以通過破壞病原真菌細胞壁的類脂層，從而使其細胞結構遭到破壞[19]。Tao等的研究表明，豐原素可以作用于病原真菌的胞內物質，如核酸等[20]。這些說法尚有待于進一步考察、確定。

據報道，解淀粉芽孢桿菌的基因組中有大量成簇的基因用于編碼抗菌肽等抑菌物質，包括細菌素和脂肽類抗生素等[21]。但是，這并不代表同一種菌在生長代謝過程中就可以同時產生所有抑菌物質，某些用來編碼或啟動抗生素合成的基因必須在某種特定的條件或階段才會正常表達[22]。解淀粉芽孢桿菌基因組中就存在多種編碼脂肽抗生素的基因簇，如編碼表面活性素的sfp、編碼伊枯草菌素的itu、編碼豐原素的fen等。

通過檢測解淀粉芽孢桿菌BA-16-8的脂肽抗菌性，結果顯示，豐原素對擴展青霉菌有明顯的抑制效果，然而由于菌株細胞本身也具有抑菌性，因此，單純通過HPLC分離純化的片段很難明確豐原素在解淀粉芽孢桿菌抑制擴展青霉菌的過程中發揮的作用。因此，采用分子遺傳學手段，構建豐原素表達缺失突變菌株，通過對比野生型和突變型的抗菌性能及防治青霉病的效果，最終確定解淀粉芽孢桿菌BA-16-8在抑制擴展青霉菌過程中發揮關鍵作用的物質是豐原素。除了擴展青霉菌感染所致的蘋果青霉病，豐原素也是抑制桃褐腐病和番茄枯萎病的主要物質。豐原素究竟是如何發揮其抑菌作用的？這種抑菌作用有沒有作用對象的特異性？在確定了豐原素防治擴展青霉菌所致的青霉病中的主導地位之后，接下來將就豐原素對擴展青霉菌的抑菌機制展開研究，以期為抗生素脂肽的開發及利用提供理論依據。

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