茶樹葉片掃描電鏡樣品制備方法的比較研究

楊國一， 于文濤， 蔡春平， 陳 笛， 謝微微， 王鵬杰， 葉乃興

(1.福建農林大學園藝學院/茶學福建省高等學校重點實驗室，福建福州 350002； 2.福建出入境檢驗檢疫局，福建福州 350001)

通信作者：葉乃興，教授，主要從事茶樹栽培育種與資源利用研究，E-mail：ynxtea@126.com；于文濤，博士，農藝師，主要從事植物系統學研究，E-mail：wtyu@foxmail.com。

應用掃描電鏡觀察生物樣品表面的微形態特征，以獲得較光學顯微鏡觀察結果更為細微的結構特征，得到具有特異性功能的微觀結構和具有分類學意義的微形態性狀[1-4]，是生物學研究的重要手段之一。在利用掃描電鏡對生物樣品的微形態進行觀察分析研究中，能否獲得真實、清晰、理想的掃描電鏡觀察結果，樣品的制備過程是關鍵，絕大多數情況需要對生物樣品進行干燥處理后才能鍍金和進行掃描電鏡觀察[5]。樣品的前期干燥處理直接影響后期觀察效果，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準確度，甚至直接導致試驗失敗[6]。含水量較多的生物樣品不僅對掃描電鏡成像造成很大的影響，同時對掃描電鏡儀器設備也會造成諸多不良后果[7]：樣品含水量多容易造成樣品倉內真空度下降，造成電子束偏移，使圖像模糊不清；造成物鏡、鏡頭、光闌等部件的污染；燈絲碰到水蒸氣而氧化變質乃至熔斷。目前，植物葉片電鏡掃描研究中的干燥方法主要有烘箱干燥法[8-9]、自然干燥法[10-12]、真空冷凍干燥法[13-16]等方法。

對于茶樹葉片來說，茶樹老葉和嫩葉含水量、角質層和上下表皮厚度都有所差異[17]，不同的葉片適合哪種干燥方式，還沒有確切的數據支持。為了探討茶樹老、嫩葉片對應的最優干燥方法，本研究選取3個品種的茶樹葉片為研究對象，每個茶樹品種取老葉以及嫩葉作為試驗材料，用場發射掃描電鏡觀察，然后對3種不同的茶樹葉片掃描電鏡樣品制備方法進行比較，旨在尋找一種理想的茶樹葉片掃描電鏡樣品制備方法，為茶樹品種葉片微形態比較研究、茶樹葉片發育過程的微形態研究等提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料采自福建農林大學教學茶園的3個品種(表1)的茶樹葉片，分別為春梢葉(老葉)和秋梢第3葉(嫩葉)，采樣時間為2016年10月下旬。

表1 3種茶樹品種的性狀描述

1.2 儀器設備

SU-8010型冷場發射掃描電鏡(日立公司，日本)；E-1010 型離子濺射鍍膜儀(日立公司，日本)；DHG-9240A型可編程電熱烘箱(上海一恒科學儀器有限公司，中國)；FD-1-50型真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司，中國)；KQ-300VDE型超聲波清洗儀(江蘇昆山舒美超聲儀器有限公司，中國)。

1.3 試驗方法

每個茶樹品種選取老葉及嫩葉，用超聲波清洗儀去除茶樹葉片表面的雜質，于同一葉片中部選取3個2 mm×2 mm大小的部分葉片作為試驗材料，分別進行烘箱干燥法、硅膠干燥法和真空冷凍干燥法處理。

烘箱干燥法：將清洗過的茶樹葉片樣品放入60 ℃烘箱中干燥4 h。

硅膠干燥法：將清洗過的茶樹葉片樣品直接放入硅膠中進行干燥處理12 h。

真空冷凍干燥法：用2.5%的戊二醛于4 ℃ 冰箱中固定3 h；用0.1 mol/L、pH值6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，每次 10 min；分別用50%、70%、80%、90%乙醇進行脫水，每次 15 min；用無水乙醇脫水3次，每次15 min；最后將材料置于100%純叔丁醇中浸泡15 min后放入真空冷凍干燥機進行干燥處理。

將3組樣品觀察面向上，用導電膠帶固定于掃描電鏡樣品臺上，用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍膜80 s。冷場發射掃描電鏡取8.0 mm工作距離、20 μA燈絲電流、6 kV加速電壓，在200倍和500倍放大倍數下對茶樹葉片進行觀察并拍照。每個處理在200倍放大倍數下取10個視野，對視野中的葉片氣孔數量進行統計，用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

由顯微圖像(圖1、圖2、圖3、圖4)可以看出，3個品種的茶樹葉片背面均有毛被，為單毛；氣孔均為復唇型氣孔，長卵形且具有腺鱗組織，氣孔器保衛細胞蠟質紋飾平滑。茶樹老葉氣孔器保衛細胞均凸出于普通表皮細胞，氣孔器外圍覆有2層皺脊，內層呈平滑、環狀閉合，外層褶皺、環狀不閉合，副衛細胞與普通表皮細胞在同一平面；茶樹嫩葉氣孔器保衛細胞略突出于普通表皮細胞，氣孔器外圍覆有1層皺脊，呈平滑、環狀閉合，副衛細胞略低于普通的表皮細胞。

2.1 茶樹葉表面紋飾與變化

由表2可知，不同茶樹品種葉片腹面均有獨特的紋飾特征，而相同的茶樹品種經不同干燥方法處理后，微形態特征存在差異。

烘箱干燥法：3個品種的茶樹葉片經過烘箱干燥處理后，在掃描電鏡觀察下，茶樹老葉原始形態保存良好，可以反映真實的微形態特征。而茶樹嫩葉表面發生較為嚴重的收縮，葉片腹面褶皺較為嚴重， 其表面紋飾均不能反映其真實的微形態特征。

硅膠干燥法：經過硅膠干燥處理后的茶樹老葉，在掃描電鏡觀察下，3個品種的茶樹葉片并沒有發生嚴重的皺縮現象。茶樹嫩葉經硅膠干燥處理后，在掃描電鏡觀察下，其葉表面發生嚴重的收縮，葉片腹面褶皺嚴重，其表面紋飾不能反映真實的微形態特征。

真空冷凍干燥法：3個品種的茶樹葉片經過真空冷凍干燥處理后，在掃描電鏡觀察下，茶樹老葉和嫩葉的原始形態均保存良好，均可以反映真實的微形態特征。

表2 3種干燥方法對茶樹葉片微形態的影響

2.2 茶樹葉表面氣孔密度與變化

對3個品種的茶樹老葉和嫩葉進行氣孔密度統計及方差分析(表3)，在茶樹老葉結果方面，本山和鐵觀音2個品種的老葉經3種方法處理后，其氣孔密度差異不顯著，而黃旦經硅膠干燥法處理后氣孔密度與烘箱干燥法和真空冷凍干燥法均差異顯著；在茶樹嫩葉結果方面，3個茶樹品種經烘箱干燥法和硅膠干燥法處理后氣孔密度均與真空冷凍干燥法差異顯著，其氣孔密度較真空冷凍干燥法均產生了較大的增加，其中本山嫩葉經烘箱干燥法處理后，氣孔密度達到了 437.67 個/mm2，較真空冷凍干燥法增加了53.75%。

2.3 綜合分析

茶樹葉片經3種不同干燥方法處理后，茶樹老葉和嫩葉呈現出不同變化：茶樹老葉經烘箱干燥法或真空冷凍法處理后，其葉片未發生收縮現象，表面紋飾和氣孔密度均未受到影響，能反映真實的微形態特征，而經硅膠干燥法處理后，雖然3個茶樹品種的葉片微形態特征均在視野中保存較好，但黃旦品種氣孔密度異常，因此硅膠干燥法并不適用于所有茶樹品種老葉干燥處理；茶樹嫩葉經真空冷凍干燥法處理后，葉表面未產生收縮現象，其表面紋飾和氣孔密度均未受到影響，能反映真實的微形態特征， 而經烘箱干燥法或硅膠干燥法處理后，均發生嚴重的收縮現象，葉片表面紋飾和氣孔密度均受到了不同程度的影響，不能反映真實的茶樹葉片微形態特征，因此烘箱干燥法和硅膠干燥法并不適用于茶樹嫩葉的干燥處理。

表3 經3種干燥方法處理后的茶樹葉片平均氣孔密度及方差分析結果

注：同列數據后的不同小寫字母表示不同處理方法差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結論

本研究中3種茶樹葉片掃描電鏡樣品制備干燥方法的原理各不相同：烘箱干燥法是利用熱空氣將熱量傳遞給葉片，氣化葉片中的水分，形成水蒸氣，從而達到快速干燥的效果；硅膠干燥法是通過硅膠干燥劑內部的毛細孔網狀結構吸收水分，并通過其物理吸引力將水分保留，從而使樣品脫水干燥；真空冷凍干燥法是將葉片在較低的溫度下凍結成固態，然后在真空條件下使其中的水分不經液態直接升華為氣態，最終使葉片脫水。對茶樹葉片進行干燥處理時，由于水具有較大的內聚力和電極性，可與樣品中的極性成分瞬間結合，在揮發干燥時會牽動樣品組分，如果葉片較嫩，含水量較高，有可能造成樣品收縮變形或微小斷裂。在茶樹老葉掃描電鏡制樣過程中，由于其含水量少，角質層和上下表皮厚度較厚等特點，烘箱干燥法和真空冷凍干燥法均適合， 但考慮到真空冷凍干

燥法的操作復雜性及成本相對較高，在進行茶樹老葉片的掃描電鏡研究中，采用烘箱干燥法是簡便、經濟、快速的制樣方法。在茶樹嫩葉掃描電鏡制樣過程中，茶樹嫩葉含水較多，角質層和上下表皮厚度較薄，采用烘箱干燥法或硅膠干燥法處理時容易發生變形收縮現象，影響觀察結果，而真空冷凍干燥法是選用高熔點的有機溶劑——叔丁醇作升華介質，使水分從固態直接轉化為氣態，不經過液態階段，因而避免了氣相和液相之間表面張力對樣品的損傷[18]。

綜上，在茶樹品種葉片微形態學比較研究、茶樹葉片發育過程研究等茶樹葉片微形態學相關研究中，如果選用茶樹老葉作為研究材料，建議采用更簡便、經濟、快速的烘箱干燥法進行樣品制備；如果需要對嫩葉的微形態特征進行觀察，建議采用保留真實形態更佳的真空冷凍干燥法作為掃描電鏡樣品制備的優選方法。

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