小花棘豆中毒和田羊丘腦-垂體-睪丸軸的病理學觀察

廖秋萍， 陳根元， 賈琦珍， 王 帥

(塔里木大學動物科學學院/新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

通信作者：王 帥，碩士，高級實驗師，主要從事動物中毒病及毒理學方面的研究。E-mail：wangshuaidky@126.com。

小花棘豆(OxytropisglabraDC.)是瘋草的一種，在新疆天然草地中廣泛分布，據不完全統計僅新疆阿克蘇地區天然草場中廣泛叢生小花棘豆的面積已超過20%。目前放牧家畜小花棘豆中毒對新疆草原畜牧業的發展危害嚴重，每年中毒的家畜占放牧總數的5%～10%，其中50%左右的中毒家畜死亡[1]。國內外研究發現，小花棘豆中毒對動物的繁殖機能影響極為明顯，可導致公畜性欲下降，精子活力降低[2]，母畜不孕、流產、難產，甚至幼畜死亡[3]。目前，研究認為動物體內的內分泌系統包括丘腦-垂體-甲狀腺軸、丘腦-垂體-腎上腺軸和丘腦-垂體-性腺軸3大系統，而動物的生殖功能依賴于內分泌腺與神經系統的調節，在生殖內分泌系統中，丘腦-垂體-性腺軸通過調節動物的性激素水平維系動物的生殖功能[4]。在雄性動物中，丘腦-垂體-性腺軸由丘腦、垂體和睪丸構成。王帥等研究發現小花棘豆中毒家兔腦組織和生殖器官均發生以空泡變性為主要特征的病理學變化，而且與小花棘豆攝入量有明顯的時間-劑量效應[5]。進一步研究發現小花棘豆中毒可通過影響綿羊丘腦-垂體-性腺軸中α-甘露糖苷酶的活性與表達，從而導致綿羊繁殖機能障礙[6]。

和田羊是新疆南疆地區的主要放牧品種，在該地區畜牧業中占有重要地位，占該地區綿羊存欄數的70.97%。近年來，和田羊小花棘豆中毒已成為該地區畜牧業發展面臨的嚴重問題[7]。本試驗通過制備小花棘豆中毒和田羊丘腦、垂體、睪丸的組織切片，利用HE染色及電子顯微鏡分別對中毒和田羊丘腦、垂體和睪丸組織的病理結構以及細胞的超微結構進行觀察，分析小花棘豆毒性成分對和田羊生殖內分泌的影響，進一步探討動物小花棘豆中毒的機理，為小花棘豆中毒的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

小花棘豆(OxytropisglabraDC.)樣品采自新疆和田市策勒縣恰哈鄉，由塔里木大學動物科學學院草業科學教研室鑒定，取植株的地上部分，風干后備用。

伊紅、蘇木精、苦味酸、乙醇、甲醛、二甲苯等試劑均為國產分析純。

CX41型生物顯微鏡，日本Olympus；HT7700型透射電子顯微鏡，日本Hitachi；RM2235型輪轉式切片機，德國Leica；TB-718型分體式生物組織包埋機，湖北泰維科技實業有限公司；YT-7C型生物組織攤烤片機，湖北孝感市亞光醫用電子技術有限公司。

1.2 試驗動物

雄性和田羊6只，體質量(32±1.4 kg)，購自兵團第十四師一牧場，其中對照羊1只，小花棘豆攻毒羊5只。對照羊自由采食青干草，每日補飼精料300 g，試驗組飼喂小花棘豆粉，每天按20 g/kg的劑量與300 g精料加水混勻，每天飼喂3次，即08：00—09：00、14：00—15：00、19：00—20：00，自行采食完后飼喂青干草，自由飲水。待試驗組均出現喜臥、站立不穩、以手提耳即出現搖頭、易突然倒地等典型臨床癥狀后進行屠宰，試驗期35 d。

1.3 和田羊丘腦、垂體和睪丸病理組織結構的觀察

取對照和田羊與中毒和田羊的丘腦、垂體和睪丸組織，分別稱取質量，再除以羊宰前體質量，即得各器官指數。然后取部分組織使用Bouin’s液(飽和苦味酸溶液75 mL，40%甲醛溶液25 mL，冰乙酸5 mL)固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后常規步驟石蠟包埋。包埋組織進行連續切片，片厚6 μm，攤片、烤片后，常規HE染色方法染色，鏡檢觀察。

1.4 和田羊丘腦、垂體和睪丸超微結構的觀察

分別取對照和田羊與中毒和田羊的丘腦、垂體和睪丸組織，部分組織切成1 mm2左右的組織塊后使用2.5%戊二醛固定，經過脫水、滲透、包埋、聚合、切片、染色等步驟后使用透射電子顯微鏡在80 kV電壓下，觀察各組織的超微結構的變化。

2 結果與分析

2.1 小花棘豆中毒對和田羊丘腦、垂體和睪丸指數的影響

由表1可知，中毒和田羊丘腦指數、垂體指數和睪丸指數均極顯著高于對照組(P<0.01)，表明飼喂小花棘豆對和田羊實質性臟器有較大的損傷。

表1 小花棘豆中毒對和田羊丘腦、垂體和睪丸指數的影響

注：同列數據后標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2 小花棘豆中毒和田羊丘腦、垂體和睪丸病理組織結構的觀察

小花棘豆中毒和田羊病理剖檢可見腦膜血管充血，其他臟器無明顯肉眼可見變化。HE染色結果(圖1)表明，與對照羊相比，小花棘豆中毒和田羊丘腦神經元細胞、神經膠質細胞的胞體均發生固縮，胞質中充滿顆粒狀尼氏體或深紫色小塊，胞核發生碎裂、濃染；垂體中可見嗜堿性細胞、嗜酸性細胞和嫌色細胞，其細胞核多發生變形、濃染，胞漿減少；睪丸中各級生精細胞排列紊亂，層數減少，管腔中的成熟精子數也明顯降低，生精小管周圍間隙變寬，睪丸支持細胞和間質細胞出現明顯空泡。

2.3 小花棘豆中毒和田羊丘腦、垂體和睪丸超微結構的觀察

經透射電鏡檢查，對照和田羊丘腦中神經細胞染色質分布均勻，核膜完整，線粒體內嵴清晰，神經髓鞘排列緊密，呈層狀結構(圖2-A)；垂體中可見促性腺激素細胞，其胞質中分泌顆粒大小不一，胞漿中線粒體、高爾基體、粗面內質網等細胞器均清晰可見(圖2-B)；睪丸中精原細胞、精母細胞、間質細胞、支持細胞和精子細胞均正常(圖2-C)。小花棘豆中毒和田羊丘腦中神經細胞染色質聚集成塊，細胞核腫脹、破裂，線粒體嵴發生斷裂，神經髓鞘排列模糊不清，板層結構離散，有些發生斷裂，另并有髓鞘球產生(圖2-D)；垂體細胞中染色質聚集，胞核碎裂，線粒體腫脹、空泡化，嵴斷裂，并可見內質網擴張(圖2-E)；睪丸中精原細胞和精母細胞均可見細胞核中染色質聚集，胞漿中的線粒體腫脹、空泡化，嵴斷裂，支持細胞和間質細胞中細胞核局部核膜不完整，成分裂狀，線粒體嵴斷裂，空泡增多，胞漿減少，精子細胞頂體膜和核膜破裂、不完整，胞質內線粒體形成空泡，染色質聚集(圖2-F)。試驗結果表明小花棘豆攻毒后和田羊丘腦、垂體和睪丸細胞的超微結構變化明顯。

3 結論與討論

臟器指數可直觀地反映毒性物質對動物內臟器官的影響， 其變化可用于初步判斷毒性物質對動物內臟器官的損害程度。丘腦、垂體和睪丸是雄性動物繁殖系統的重要器官，其中垂體是家畜分泌激素調控中心，睪丸是多種垂體激素的作用受體。本試驗中小花棘豆中毒和田羊丘腦指數、垂體指數和睪丸指數均極顯著高于對照組(P<0.01)，與鄧利等的研究結果[8]一致。試驗結果表明，小花棘豆毒性成分對和田羊丘腦、垂體和睪丸組織均有較大程度的損傷，其對中毒動物繁殖機能的影響可能與丘腦-垂體-睪丸軸損傷有關。

丘腦是調節內臟活動和內分泌活動的較高級神經中樞所在，可分為弓狀核、視交叉上核、視上核、室旁核等部分；垂體包括腺垂體和神經垂體，主要由嗜堿性細胞、嗜酸性細胞和嫌色細胞組成，其中嗜堿性細胞包括促性腺激素細胞、促甲狀腺激素細胞和促腎上腺皮質細胞，嗜酸性細胞包括生長激素細胞和催乳素細胞；睪丸組織主要由支持細胞、間質細胞和各級生精細胞組成。本試驗中，小花棘豆中毒和田羊丘腦神經元細胞和神經膠質細胞均發生固縮、胞核碎裂、濃染；垂體中細胞多發生胞核變形、濃染，胞漿減少；睪丸中各級生精細胞排列紊亂，層數減少，管腔中的成熟精子數也明顯降低，生精小管周圍間隙變寬，睪丸支持細胞和間質細胞出現明顯空泡。賈琦珍等的研究發現小花棘豆中毒可顯著影響家兔丘腦中α-甘露糖苷酶的活性與表達，并可導致家兔丘腦細胞損傷[9]；丁伯良等的研究認為甘肅棘豆(主要毒性成分為苦馬豆素，與小花棘豆一致)中毒山羊睪丸的曲細精管及生精上皮細胞明顯損傷[10]。本試驗結果均與之一致，結果表明小花棘豆毒性成分可作用于和田羊丘腦-垂體-睪丸軸，導致其激素分泌受阻，精子無法正常發生，直接影響精子質量，從而影響雄性和田羊的生殖功能。

丘腦中的神經元多為內分泌神經元，主要調節神經內分泌系統，其中與動物生殖功能密切相關的為促性腺激素釋放激素神經元。垂體可控制動物機體中與生長、代謝、發育和繁殖等功能相關的激素分泌，但這些激素分泌依賴于相應的分泌細胞。睪丸是雄性動物主要的生殖器官，其主要功能是分泌雄性激素，產生精子。其精子發生的過程是由相對不分化的精原細胞逐漸發育為高度分化的成熟精子。本試驗結果表明，小花棘豆中毒和田羊丘腦中神經細胞染色質聚集成塊，細胞核腫脹、破裂，線粒體嵴發生斷裂，神經髓鞘排列模糊不清，板層結構離散，有些發生斷裂，另并有髓鞘球產生。髓鞘可以提高神經沖動傳導的速度，保護軸突，在維持腦功能中起著重要的作用[11]。髓鞘結構的紊亂會降低神經沖動的傳導效率，小花棘豆毒性成分可能借此影響動物的丘腦功能。中毒羊垂體細胞中染色質聚集，胞核碎裂，線粒體腫脹、空泡化，嵴斷裂，并可見內質網擴張。線粒體可為細胞提供生命活動所必需的能量，在細胞代謝中占有重要地位。因此，細胞內線粒體超微結構的改變可能會直接影響細胞的功能，如激素的分泌和釋放等。睪丸中精原細胞和精母細胞均可見細胞核中染色質聚集，胞漿中的線粒體腫脹、空泡化，嵴斷裂，支持細胞和間質細胞中細胞核局部核膜不完整，成分裂狀，線粒體嵴斷裂，空泡增多，胞漿減少，精子細胞頂體膜和核膜破裂、不完整，胞質內線粒體形成空泡，染色質聚集。支持細胞是雄性動物生殖系統的重要組成部分，作為生精上皮中的唯一體細胞，對生殖細胞具有支持和營養的作用，間質細胞主要合成和分泌睪酮，具有促進生殖器官發育，維持正常性欲及動物第二性征等作用，并可調節生精上皮的生精過程[12]。小花棘豆毒性成分可顯著影響雄性和田羊支持細胞和間質細胞的超微結構變，可能會對雄性激素的分泌與生精過程產生直接影響，進而影響精子形成的其它環節，從而影響雄性動物的生殖功能。

小花棘豆攻毒可導致雄性和田羊丘腦、垂體和睪丸的組織形態結構發生明顯的病理變化，其中中毒和田羊丘腦指數、垂體指數和睪丸指數均極顯著升高(P<0.01)，丘腦神經元細胞固縮、濃染；垂體中細胞核變形、濃染，胞漿減少；睪丸曲精細管細胞排列紊亂，管壁變薄，管腔內精子數量減少，睪丸支持細胞和間質細胞出現明顯空泡。透射電鏡結果顯示，小花棘豆中毒和田羊丘腦中神經元細胞核染色質聚集，線粒體嵴斷裂，神經髓鞘端板層離散；垂體中促性腺激素細胞核染色質聚集，線粒體腫脹呈空泡狀，內質網擴張；睪丸中精原細胞和精母細胞胞質內線粒體腫脹形成空泡，精子細胞核膜破裂，胞質內線粒體腫脹形成空泡，嵴斷裂，部分精子細胞缺少頂體顆粒。小花棘豆中毒可造成雄性和田羊丘腦、垂體及睪丸組織顯微和超微結構的改變，從而影響其繁殖機能。

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