山東省某地區肉雞H9亞型禽流感與大腸桿菌混合感染的診治

畢志香， 朱亞露， 趙 陽， 張元鵬， 于曉明， 揭鴻英， 何家惠， 于 漾

(江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京 210014)

通信作者：于 漾，碩士，助理研究員，主要從事禽用疫苗研究。E-mail：yangyu1719223@163.com。

2015年3月中旬，山東省某地區連片家禽專業養殖戶飼養的817肉雞及青腳麻雞先后發病并陸續死亡，主要表現呼吸道癥狀，有的拉黃、綠稀糞，減食，精神萎頓，發病率達60%～70%，病死率達15%～30%，使用多種抗生素治療效果不明顯。5家專業戶送檢病死雞共60余只。對所有發病雞均解剖，觀察病理變化，并采集病變臟器，肝、肺、腎、法氏囊及氣管等，通過流行病學調查及實驗室檢測等方法進行診斷，現將確診為H9亞型禽流感與大腸桿菌混合感染診斷結果報告如下。

1 發病情況

本次發病雞為山東省某鄉鎮多個個體養殖戶飼養的817肉雞和青腳麻雞，5個養殖場飼養規模均為8 500只左右，24～38日齡雞發病嚴重。臨床表現為精神沉郁、打堆、羽毛蓬松、縮頸垂翅、打盹、食量減少、咳嗽、張口呼吸、排糞異常，發病率60%～70%，病死率達15%～30%。經常規抗生素和抗病毒藥治療均無明顯效果。

2 免疫程序

本鄉鎮的養雞合作社使用統一的免疫程序為7日齡：ND-IB 點眼滴鼻；14日齡：IBDV活苗免疫；21日齡：ND弱毒疫苗點眼滴鼻。

3 解剖病理變化

共解剖病死雞60只，剖檢病變為纖維素性心包炎、肝周炎(38/60)；氣囊渾濁、增厚(12/60)；氣管內有較多黏液(40/60)，氣管和支氣管交匯處有白色干酪樣栓塞物(40/60)；肌胃和腺胃交界處有出血(20/60)，腺胃粘膜潰瘍、脫落(20/60)；脾臟壞死(10/60)；法氏囊萎縮(45/60)；腎臟腫大(40/60)。

4 實驗室診斷

4.1 細菌分離和藥敏試驗

4.1.1 細菌分離和培養特性觀察 無菌采取病死雞的肝臟組織，劃線接種到普通營養瓊脂和麥康凱瓊脂上，37 ℃培養24 h，可見在普通營養瓊脂培養基上生長成突起、濕潤、乳白色圓形菌落，麥康凱瓊脂上形成光滑、濕潤、圓形、紅色菌落；挑取紅色菌落經革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓的紅色短小桿菌。對菌落進行純化培養后進一步做生化試驗，結果顯示分離菌能迅速發酵乳糖、葡萄糖、甘露醇，產酸產氣，產生靛基質等，符合大腸桿菌的生化特征。

4.1.2 藥敏試驗 選取麥康凱瓊脂上長出的紅色菌落，均勻劃線于麥康凱平板，再放置相應的藥敏試紙，37 ℃培養，24 h后觀察測量抑菌圈的大小并記錄結果。判定標準采用美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)標準。結果對頭孢喹肟鈉高度敏感；對頭孢噻吩鈉、丁胺卡那霉素輕度敏感；對阿莫西林、氟苯尼考、恩諾沙星、強力霉素、氨芐青霉素不敏感(表1)。

4.2 病毒分離

4.2.1 雞胚接種 分別將5個養殖戶的病死雞的肺臟、氣管用剪刀剪成1 cm3左右大小，按1 ∶5(體積比)比例加入無菌PBS溶液，用研缽磨成糊狀后，再加入終濃度為2 000 U/mL雙抗溶液，混勻后置于4 ℃冰箱作用2 h后，反復凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清再用0.22 μm的一次性濾器過濾，取濾液尿囊腔和尿囊膜接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，每個樣品接種5枚。雞胚接種后棄去24 h非特異性死亡胚，大部分雞胚在72～96 h死亡，收獲死亡胚，收集其尿囊液，取出死胚發現胚體全身彌漫性出血，而尿囊膜沒有

表1 藥敏試驗結果

注：高度敏感標記為“+++”；中度敏感標記為“++”；輕度敏感標記為“+”；不敏感標記為“-”。

增厚等病理變化。

4.2.2 尿囊液的血凝價測定 按現行獸藥典中的方法進行微量血凝試驗。取上述各組死亡雞胚的尿囊液，逐組檢測其血凝價，結果血凝價均為7log2～9log2。

4.2.3 尿囊液的特異性檢測 按現行獸藥典中的方法進行微量血凝抑制試驗。將5家養殖戶病死雞病料接種雞胚后收獲的尿囊液，分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、雞減蛋綜合癥標準陽性血清進行紅細胞凝集抑制試驗。結果顯示，所有樣品均與H5和H7亞型禽流感、雞新城疫、雞減蛋綜合癥標準陽性血清呈陰性反應，僅與H9亞型禽流感血清呈陽性反應，HI抑制效價為8log2～9log2。

4.2.4 分子生物學鑒定 用RT-PCR法，分別對5個養殖戶病死雞病料接種雞胚收獲的尿囊液進行H5N1、H9N2、新城疫、傳染性支氣管炎4種病原核酸檢測，結果顯示，H5N1、新城疫、傳染性支氣管炎病原為陰性，H9亞型禽流感病原為陽性，均擴增出700 bp的目的片段(圖1)。將擴增的5株H9亞型禽流感病毒的HA基因進行測序，結果5株病毒的核酸序列完全相同，與國內2014年、2015年公布的H9N2流行毒株同源性高于98.8%且處于進化樹的同一分支上(圖1、圖2、圖3)。

4.2.5 IBD瓊脂擴散試驗 將發病雞萎縮的法氏囊組織按 1 ∶3 (體積比)的比例加入無菌PBS溶液研磨成糊狀、凍融3次，8 000 r/min 離心10 min。取上清，用瓊脂擴散試驗檢測法氏囊組織中是否含有法氏囊病毒，結果瓊脂擴散試驗均為陰性。

5 結論

根據流行病學情況調查、臨床癥狀和病理變化觀察以及實驗室診斷，分析判定該片養殖戶雞群為H9亞型禽流感和大腸桿菌混合感染。

6 防治措施

6.1 防疫

及時調整免疫程序，在7日齡新城疫、傳染性支氣管炎二聯弱毒疫苗點眼滴鼻免疫的同時，增加新城疫、H9亞型禽流感、傳染性法氏囊三聯滅活疫苗皮下注射免疫。免疫程序調整后28 d，對雞群采血，檢測ND、H9和IBD抗體水平。由表2可知，在調整免疫程序后，ND、H9疫苗的抗體水平明顯上升，所有雞的H9抗體效價平均為7.6log2，ND抗體效價平均為6.6log2。而IBD瓊擴抗體效價平均為2.7log2。

表2 ND、H9 HI抗體水平及IBD瓊擴抗體水平

6.2 治療

整個雞群在飼料中添加高度敏感藥物頭孢喹肟鈉，按每噸飼料500 g拌料，并在飼料中添加高質量的電解多維。

6.3 清場與消毒

對已發病的雞場適時全部清場，對雞場內的主干道及雞舍內的過道用20%的石灰乳進行全覆蓋消毒。在飼養過程中應注意飼養環境的改善，寒冷季節保溫的同時還應注意通風，飼養密度不能太大，10～11只/m2，以免雞舍的有害氣體濃度過大刺激肉雞呼吸道，使呼吸道疾病加劇。

發病養雞場通過飼喂敏感藥物頭孢喹肟鈉，發病及死亡雞有所下降；新進雛雞前全場進行嚴格消毒并調整免疫程序，相關疫苗抗體水平明顯提高。新發病例逐步減少，整個區域的養雞場狀況逐漸平穩。

7 小結與討論

7.1 H9亞型禽流感疫苗免疫的重要性

H9亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒，主要侵害雞的呼吸系統，是當前危害肉雞的主要疫病之一[1]。H9亞型禽流感病毒隱性感染存在一定的普遍性，單獨感染H9亞型禽流感，沒有明顯的臨床表現，當存在某些致病因子或發生重大應激時，H9亞型禽流感就表現出巨大的危害，例如，H9與新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病毒、大腸桿菌以及霉菌毒素等的混合感染[2]。H9亞型禽流感與大腸桿菌混合感染多年來就有不斷的報導[3-5]，特別是在肉雞飼養過程中，養殖戶存在僥幸心理，擔心注射油苗影響出欄時雞肉的品質而不免疫禽流感疫苗，若飼養環境較差，H9與大腸桿菌的混合感染就比較常見，勢必引起很大的經濟損失，因此應該重視并嚴格認真做好H9亞型禽流感疫苗的免疫，特別是在禽流感的高發季節(冬春、秋冬交替季節)更要加強H9亞型禽流感疫苗的免疫接種。

7.2 傳染性法氏囊疫苗的免疫

傳染性法氏囊活疫苗多在肉雞14日齡進行免疫，由于現在采用的疫苗多是中等毒力的活苗，免疫后4 d法氏囊開始萎縮，引起雞的免疫抑制[6]，因此在活苗免疫后而抗體未產生前要增強雞體的抵抗力，可以選用增強免疫的中藥方劑進行保健[7]以防免疫抑制引起其他病原的感染。另外，為了防止法氏囊活苗對機體免疫力的影響，可以選用法氏囊滅活疫苗。在本次案例中，建議養殖戶改用法氏囊滅活疫苗，收到很好的效果。

7.3 加強飼養管理

大腸桿菌是一種條件致病菌，在冬春季節，雞舍因過于要求保溫而忽視了通風，造成雞舍內病原微生物及氨氣濃度過高，會誘發該病，因此應加強飼養管理，注意環境通風。

7.4 抗菌藥物的正確使用

當前，由于抗菌藥物在肉雞養殖中的大量使用，很多細菌已經對大部分常規抗生素產生廣泛耐藥性和多重耐藥性[8]，因此，應定期對致病性細菌進行抗生素敏感性檢測，以選取有效的抗菌藥物。

參考文獻：

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