不同形式無(wú)機(jī)碳對(duì)葛仙米的生理影響

劉樹(shù)文，時(shí)功平

(貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550018)

葛仙米(NostocsphaeroidesKützing)生長(zhǎng)于水稻田中，生長(zhǎng)期為11月至次年5月，在世界范圍內(nèi)其分布稀少，產(chǎn)量甚微(7.5 kg/hm2左右)，除湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)有約667 hm2分布外，在非洲僅有約0.73 hm2的葛仙米分布量[1]。葛仙米是我國(guó)傳統(tǒng)出口的一種珍貴野生的食藥兩用固氮藍(lán)藻，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，食用歷史悠久[1]。另外，其蛋白含量較高，含有豐富的人體必需的各種氨基酸、脂肪酸、維生素及礦質(zhì)元素，并且含有具有各種藥用價(jià)值的多糖、色素等，此外，葛仙米還含有超氧化物歧化酶等生理活性物質(zhì)[2-3]。因此，葛仙米在保健食品、食品添加劑、動(dòng)物飼料、醫(yī)藥、美容以及精細(xì)化加工品等領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[1，4]。

陸生植物主要通過(guò)氣孔吸收利用空氣中的CO2進(jìn)行光合作用。CO2、HCO3-和CO32-在水體中能夠通過(guò)如下反應(yīng)進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化：CO2+OH-HCO3-，HCO3-+OH-CO32-+H2O[5]。水體中溶解的CO2濃度遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足藻類(lèi)的需求，水生藍(lán)藻除了能夠直接吸收利用溶解在水體中的CO2以外，還可以通過(guò)二氧化碳濃縮機(jī)制(CO2concentrating mechanism，簡(jiǎn)稱(chēng)CCM)吸收利用水體中的HCO3-[6]。藍(lán)藻可通過(guò)細(xì)胞膜上的多種HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將溶解在水體中的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，胞內(nèi)的碳酸酐酶(carbonic anhydrase，簡(jiǎn)稱(chēng)CA)可催化HCO3-形成CO2，并且在核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase，簡(jiǎn)稱(chēng)RubisCO)的作用下將CO2固定生成3-磷酸甘油酸后參與細(xì)胞的各種代謝途徑[6]。

王思瑩的研究表明，銅綠微囊藻可以直接或間接利用水體中的碳酸氫鹽作為無(wú)機(jī)碳進(jìn)行光合作用，無(wú)機(jī)碳濃度能影響銅綠微囊藻的生長(zhǎng)以及對(duì)氮磷的利用[7]。繆曉玲等對(duì)海洋浮游藻無(wú)機(jī)碳利用機(jī)制的研究表明，在其指數(shù)期和靜止期海洋浮游藻對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用途徑不同，指數(shù)期通過(guò)HCO3-直接吸收途徑，靜止期則是通過(guò)CO2吸收途徑[8]。張君枝等研究了水體無(wú)機(jī)碳濃度升高對(duì)藍(lán)綠藻生長(zhǎng)、種群競(jìng)爭(zhēng)的影響，結(jié)果表明，高濃度CO2促進(jìn)藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)中蛋白核的增大和藻細(xì)胞個(gè)體的增殖，細(xì)胞體積較小的藻類(lèi)對(duì)CO2濃度的響應(yīng)更明顯[9]。劉繼勇研究表明，食用藍(lán)藻葛仙米能夠直接利用HCO3-進(jìn)行光合作用，通氣培養(yǎng)的葛仙米具有多種CO2、HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子，Na+依賴(lài)型HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)是葛仙米最主要的獲取無(wú)機(jī)碳的方式[10]。劉然等研究了不同濃度的NaHCO3、CO2對(duì)海洋單細(xì)胞微藻粉核油球藻(PinguiococcuspyrenoidosusCCMP 2078)生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，適當(dāng)提高NaHCO3、CO2濃度均能顯著促進(jìn)粉核油球藻的生長(zhǎng)[11]。鄭洪立等研究表明，海洋小球藻(ChlorellavulgarisLICME001)能利用Na2CO3、NaHCO3和CO2產(chǎn)油，產(chǎn)油量隨著3種形式無(wú)機(jī)碳濃度的增加先升高后降低，且Na2CO3、NaHCO3較CO2更有利于小球藻積累不飽和脂肪酸[12]。

目前，葛仙米的人工養(yǎng)殖已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但國(guó)內(nèi)外對(duì)葛仙米的研究相對(duì)較少，對(duì)其開(kāi)發(fā)利用也沒(méi)有像小球藻(Chlorella)、螺旋藻(Spirulina)和鹽藻(Dunaliella)那樣已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[13]。葛仙米以其資源稀少、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、獨(dú)特的生物活性和藥理作用引起人們廣泛的關(guān)注。葛仙米的人工養(yǎng)殖技術(shù)于2003年通過(guò)湖北省科技廳組織的科技成果鑒定，為早日實(shí)現(xiàn)葛仙米商業(yè)化培養(yǎng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[14]。但是目前因?yàn)楦鹣擅椎娜斯づ囵B(yǎng)技術(shù)還存在產(chǎn)量較低等問(wèn)題，還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工廠化養(yǎng)殖[13]。Chen等研究了磷對(duì)葛仙米生長(zhǎng)和光合作用的影響[15]，文靖研究了鈣對(duì)葛仙米生理生化特性的影響[16]。本試驗(yàn)比較研究了人工養(yǎng)殖的葛仙米在以CO2、Na2CO3單獨(dú)提供碳源以及兩者同時(shí)提供碳源(CO2+Na2CO3)的培養(yǎng)條件下葛仙米的生理響應(yīng)差異，以期尋找最適合葛仙米生長(zhǎng)的無(wú)機(jī)碳形式，為葛仙米的人工養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年4月，從貴州省岑鞏縣凱本鄉(xiāng)沈家灣村水稻田中采集得到新鮮野生葛仙米球形群體。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將葛仙米球形體用無(wú)菌蒸餾水沖洗干凈，再用75%乙醇溶液浸泡30 s，去除雜藻，然后用無(wú)菌BG110(無(wú)氮的BG11培養(yǎng)基)培養(yǎng)液清洗3次，再放入與葛仙米群體質(zhì)量相同的培養(yǎng)液，用玻璃勻漿器勻漿成絲狀藻漿。將絲狀藻漿用BG110培養(yǎng)液稀釋?zhuān)跍囟燃s為23 ℃、光照度約為1 000 lx的條件下通入空氣進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)15 d培養(yǎng)后得到無(wú)雜菌、雜藻的貴州野生葛仙米藻種。

1.2 培養(yǎng)條件

配制BG110培養(yǎng)基(含0.02 g/L Na2CO3，不含NaNO3)以及不含Na2CO3的BG110培養(yǎng)基(不含NaNO3)，BG110培養(yǎng)基和不含Na2CO3的BG110培養(yǎng)基用0.5 molL NaOH、HCl將pH值調(diào)至7.0。將配制好的培養(yǎng)基在121 ℃、1.05 kg/cm2下滅菌30 min。藻種經(jīng)過(guò)勻漿后分別接種到9個(gè)經(jīng)過(guò)高壓滅菌的500 mL錐形瓶中，其中6瓶加入BG110培養(yǎng)基，另外3瓶加入不含Na2CO3的BG110培養(yǎng)基，每瓶藻液的總體積為400 mL。將試驗(yàn)分為3個(gè)組進(jìn)行培養(yǎng)，用空氣泵通入經(jīng) 0.22 μm 濾膜過(guò)濾的無(wú)菌空氣，通氣量為300 mL/min。第1組由空氣中的CO2和培養(yǎng)液中的Na2CO3同時(shí)提供碳源，第2組由空氣中的CO2單獨(dú)提供碳源(BG110不含Na2CO3)，第3組由Na2CO3單獨(dú)提供碳源(采用高濃度的NaOH溶液及飽和的澄清石灰水組成的CO2過(guò)濾裝置將空氣中的CO2去除)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)溫度為26 ℃，用30 W日光燈進(jìn)行光照，光照度通過(guò)照度計(jì)測(cè)定，培養(yǎng)光照度為1 500 lx，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，經(jīng)過(guò)8 d光照培養(yǎng)后取3個(gè)組的藻樣測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3 比生長(zhǎng)速率的測(cè)定

從9個(gè)錐形瓶中各取藻液20 mL，離心30 min，倒掉上清液，加入3 mL 95%乙醇，振蕩，放入4 ℃冰箱中24 h。4 000 r/min 離心30 min后取上清液，用分光光度計(jì)測(cè)定D665 nm和D649 nm。葉綠素a(chlorophyll a，簡(jiǎn)稱(chēng)Chla)含量依據(jù)下列公式計(jì)算[17]：CChl a=13.95D665 nm-6.88D649 nm。比生長(zhǎng)速率(μ)依據(jù)下列公式計(jì)算：μ=(lnX1-lnX2)/(T2-T1)。式中：X1、X2分別是T1(初始)、T2(第8天)時(shí)的葉綠素a含量。

1.4 各種光合色素含量的測(cè)定

從各組葛仙米培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，倒掉上清液，加入4 mL 95%乙醇，于4 ℃冰箱中放置24 h，于4 000 r/min離心30 min，取上清液，用分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)665、649、470 nm下測(cè)定其吸光度。葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素(carotenoids，簡(jiǎn)稱(chēng)Car)含量(葛仙米是藍(lán)藻，因此不含葉綠素b)依據(jù)下列公式計(jì)算[17]：CChla=13.95D665 nm-6.88D649 nm；CCar=1 000D470 nm-2.05CChla-114.8CChlb。

從各組葛仙米培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清，各加入4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，于4 000 r/min離心30 min。取上清，用分光光度計(jì)分別測(cè)定上清液在562、615、652 nm波長(zhǎng)下的吸光度D562nm、D615 nm、D652 nm。藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡(jiǎn)稱(chēng)PC)、別藻藍(lán)蛋白(allophyxoxyanin，簡(jiǎn)稱(chēng)APC)和藻紅蛋白(phycoerythrin，簡(jiǎn)稱(chēng)PE)的含量根據(jù)Siegelman等的方法計(jì)算[18]：CPC(mg/mL)=(D615 nm-0.474D652 nm)/5.34；CAPC(mg/mL)=(D652 nm-0.208D615 nm)/5.09；CPE(mg/mL)=(D562 nm-2.41CPC-0.849CAPC)/9.62。

1.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

從各組葛仙米培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，于4 000 r/min離心30 min，去上清，各加入4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，于4 000 r/min離心30 min。上清液中蛋白質(zhì)含量依據(jù)考馬斯量藍(lán)法測(cè)定[17]。

1.6 可溶性糖含量的測(cè)定

從各組葛仙米培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，于4 000 r/min離心30 min，去上清，各加入4 mL蒸餾水，冰浴勻漿90次，4 000 r/min 離心30 min。上清液中可溶性糖含量依據(jù)蒽酮試劑法測(cè)定[17]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

本研究主要用軟件Origin 8.0作圖，用STATISTICA?7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey顯著性檢驗(yàn)(HSD)來(lái)分析不同處理間的顯著性水平。正態(tài)分布和方差同質(zhì)性分析分別采用Lilliefors檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形式無(wú)機(jī)碳培養(yǎng)條件下葛仙米的生長(zhǎng)情況

圖1表明，葛仙米分別在含有CO2+Na2CO3、CO2、Na2CO3不同形式的無(wú)機(jī)碳培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 d后，以葉綠素濃度表示的生物量分別增加到初始值的7.4、6.4、3.6倍。表1表明，分別用CO2、Na2CO3提供碳源時(shí)，葛仙米的比生長(zhǎng)速率分別降低到CO2、Na2CO3同時(shí)提供碳源時(shí)的93.2%、57.4%。以CO2和Na2CO3同時(shí)作為碳源時(shí)，葛仙米培養(yǎng)2～8 d的生物量(以葉綠素a含量表示)分別高于以Na2CO3或CO2單獨(dú)作為碳源時(shí)葛仙米的生物量(圖1)，其比生長(zhǎng)速率也顯著高于以Na2CO3或CO2單獨(dú)作為碳源時(shí)葛仙米的比生長(zhǎng)速率(Tukey’s HSD，P<0.05)(表1)。以CO2單獨(dú)作為碳源時(shí)，葛仙米培養(yǎng)2～8 d的生物量分別高于以Na2CO3單獨(dú)作為碳源時(shí)葛仙米的生物量(圖1)，其比生長(zhǎng)速率也顯著高于Na2CO3單獨(dú)作為碳源時(shí)葛仙米的比生長(zhǎng)速率(Tukey’s HSD，P<0.05)(表1)。

表1 不同形式無(wú)機(jī)碳培養(yǎng)條件下葛仙米的比生長(zhǎng)速率

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2 不同形式無(wú)機(jī)碳培養(yǎng)條件下葛仙米各種光合色素含量的變化

在不同形式的無(wú)機(jī)碳培養(yǎng)條件下，葛仙米的PC、APC、PE含量以及Chla、Car含量分別見(jiàn)表2和表3。可以看出，以CO2單獨(dú)提供碳源時(shí)，葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car含量分別降低到CO2、Na2CO3同時(shí)提供碳源時(shí)的63.01%、38.66%、78.99%、79.89%、90.98%。以Na2CO3單獨(dú)提供碳源時(shí)，葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car含量分別降低到CO2、Na2CO3同時(shí)提供碳源時(shí)的50.87%、26.80%、41.89%、50.68%、53.45%。以CO2單獨(dú)作為碳源時(shí)，葛仙米的各種光合色素含量顯著高于以Na2CO3單獨(dú)作為碳源時(shí)葛仙米的各種光合色素含量(Tukey’s HSD，P<0.05)。可以看出，不同形式無(wú)機(jī)碳對(duì)葛仙米的藻紅蛋白影響最大，對(duì)葛仙米的葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素影響較小。

表2 不同形式無(wú)機(jī)碳源培養(yǎng)條件下葛仙米的PC、APC、PE含量

表3 不同形式無(wú)機(jī)碳源培養(yǎng)條件下葛仙米的Chla和Car含量

2.3 不同形式無(wú)機(jī)碳培養(yǎng)條件下葛仙米可溶性蛋白含量的變化

圖2為蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，其直線方程為y=0.006x+0.043(r2=0.979)。根據(jù)直線方程計(jì)算得到不同形式無(wú)機(jī)碳源培養(yǎng)下葛仙米可溶性蛋白含量，由圖3可以看出，當(dāng)CO2、Na2CO3同時(shí)作為碳源時(shí)，葛仙米的可溶性蛋白含量最高(Tukey’sHSD，P<0.05)。當(dāng)葛仙米的培養(yǎng)分別以CO2、

Na2CO3單獨(dú)提供碳源時(shí)，葛仙米的可溶性蛋白含量分別降低到兩者同時(shí)提供碳源時(shí)的62.5%、55.6%(Tukey’s HSD，P<0.05)。以CO2單獨(dú)作為碳源培養(yǎng)時(shí)，葛仙米的可溶性蛋白含量顯著高于以Na2CO3單獨(dú)作為碳源時(shí)葛仙米的可溶性蛋白含量(Tukey’s HSD，P<0.05)。

2.4 不同形式無(wú)機(jī)碳培養(yǎng)條件下葛仙米可溶性糖含量的變化

圖4為可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其直線方程為y=0.005x-0.018(r2=0.989)。根據(jù)直線方程計(jì)算得到不同形式的無(wú)機(jī)碳源培養(yǎng)下葛仙米可溶性糖含量如圖5所示。當(dāng)以CO2和Na2CO3同時(shí)作為碳源時(shí)，葛仙米的可溶性糖含量最高(Tukey’s HSD，P<0.05)。當(dāng)葛仙米的培養(yǎng)分別以CO2、Na2CO3單獨(dú)提供碳源時(shí)，葛仙米的可溶性糖含量均分別降低到兩者同時(shí)提供碳源時(shí)的71.4%、47.6%(Tukey’s HSD，P<0.05)。以CO2單獨(dú)作為碳源時(shí)，葛仙米的可溶性糖含量顯著高于以Na2CO3單獨(dú)作為碳源時(shí)葛仙米的可溶性糖含量(Tukey’s HSD，P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

以CO2單獨(dú)作為碳源時(shí)，葛仙米的以葉綠素含量表示的生物量、比生長(zhǎng)速率以及葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、可溶性糖及可溶性蛋白含量大都顯著高于以Na2CO3單獨(dú)作為碳源時(shí)葛仙米的上述各項(xiàng)生理指標(biāo)(Tukey’s HSD，P<0.05)。因此可見(jiàn)，CO2是葛仙米優(yōu)先利用的無(wú)機(jī)碳形式。CO32-在培養(yǎng)液中需要通過(guò)水解作用轉(zhuǎn)化為HCO3-而被葛仙米作為碳源吸收利用，而培養(yǎng)液中溶解的CO2可以被藻細(xì)胞直接吸收利用[6]。根據(jù)藻類(lèi)的CO2濃縮機(jī)制，由于CO2的轉(zhuǎn)運(yùn)不消耗能力，因此在多種碳源中藻類(lèi)更傾向于吸收水中的溶解 CO2[19]。水體中溶解的CO2升高，減少了藻細(xì)胞對(duì)HCO3-的轉(zhuǎn)運(yùn)，節(jié)省了更多的能量，更有利于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]。郭琪等研究表明，提高CO2濃度較大程度地提高了柵藻的碳固定速率和油脂積累[20]。今后我們將進(jìn)一步探討不同濃度的CO2對(duì)葛仙米的生理影響，探討增加葛仙米產(chǎn)量的更加優(yōu)化的培養(yǎng)條件。

雖然以Na2CO3單獨(dú)作為碳源時(shí)，對(duì)葛仙米的生長(zhǎng)促進(jìn)作用較小，但在含有Na2CO3的BG110培養(yǎng)液中通入含有CO2的空氣，能最大程度地促進(jìn)葛仙米的生長(zhǎng)。CO32-在培養(yǎng)液中不僅能通過(guò)水解轉(zhuǎn)化為HCO3-而被葛仙米作為碳源吸收利用，而且具有調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值的作用。在一定范圍內(nèi)，培養(yǎng)液的pH值越高，CO2的利用率也越高[14]。不同藻類(lèi)有不同的最適pH值[21]，藻類(lèi)在吸收利用水體中溶解的無(wú)機(jī)碳時(shí)，會(huì)造成水體中pH值升高，過(guò)高的pH值會(huì)影響葛仙米藻細(xì)胞對(duì)鐵等微量元素的吸收利用，繼而影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)[22]。向含有Na2CO3的培養(yǎng)液中通入含有CO2的空氣，能使培養(yǎng)液過(guò)高的pH值適當(dāng)降低[14]。由于不同的無(wú)機(jī)碳形式對(duì)培養(yǎng)液pH值的影響不同，pH值也會(huì)影響葛仙米藻細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)碳的利用。因此本研究在配制培養(yǎng)液時(shí)用0.5 mol/L NaOH和HCl將各種培養(yǎng)液的初始pH值調(diào)至7.0[12]。但葛仙米藻細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中pH值會(huì)不斷變化，今后應(yīng)該進(jìn)一步研究固定pH值下各種形式無(wú)機(jī)碳對(duì)葛仙米生長(zhǎng)的影響。

與CO2和Na2CO3同時(shí)提供碳源時(shí)相比，CO2或Na2CO3單獨(dú)提供碳源時(shí)，葛仙米的以葉綠素含量表示的生物量、比生長(zhǎng)速率以及葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有不同程度的降低(Tukey’s HSD，P<0.05)。因此在葛仙米的人工養(yǎng)殖過(guò)程中，除了應(yīng)該在培養(yǎng)液中加入Na2CO3作為葛仙米的碳源，同時(shí)應(yīng)該通入含有CO2的空氣，才能使葛仙米保持最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，提高葛仙米的產(chǎn)量和品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳德文，汪興平，潘思軼. 葛仙米的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J]. 食品科學(xué)，2003，24(11)：153-156.

[2]劉金龍. 葛仙米營(yíng)養(yǎng)成分研究[J]. 中草藥，2000，31(11)：862-863.

[3]夏建榮，高坤山. 球形念珠藻的生化組成分析[J]. 武漢植物學(xué)研究，2002，20(3)：223-224.

[4]畢永紅，胡征宇. 葛仙米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其開(kāi)發(fā)利用[J]. 中國(guó)野生植物資源，2004，23(1)：40-42.

[5]岳國(guó)峰. 藻類(lèi)無(wú)機(jī)碳營(yíng)養(yǎng)的研究進(jìn)展(Ⅱ)——藻類(lèi)利用無(wú)機(jī)碳的機(jī)理及其調(diào)節(jié)[J]. 海洋科學(xué)，2003，27(6)：31-34.

[6]Giordano M，Beardall J，Raven J A. CO2concentrating mechanisms in algae：mechanisms，environmental modulation，and evolution[J]. Annual Review of Plant Biology，2005，56(1)：99-131.

[7]王思瑩. 無(wú)機(jī)碳對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)特性的影響研究[D]. 北京：北京建筑大學(xué)，2015.

[8]繆曉玲，Merrett M J. 海洋浮游藻(Emilianiahuxleyi)無(wú)機(jī)碳利用機(jī)理[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1998，27(4)：44-48.

[9]張君枝，王 齊，馬文林，等. 水體無(wú)機(jī)碳升高對(duì)藍(lán)綠藻生長(zhǎng)和種群競(jìng)爭(zhēng)的影響研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2015，24(7)：1245-1252.

[10]劉繼勇. 食用藍(lán)藻葛仙米的二氧化碳濃縮機(jī)制及其生理生態(tài)學(xué)研究[D]. 武漢：華中師范大學(xué)，2004.

[11]劉 然，劉曉娟，王 銘，等. 不同無(wú)機(jī)碳源對(duì)粉核油球藻生長(zhǎng)的影響[J]. 生態(tài)科學(xué)，2007，26(3)：227-231.

[12]鄭洪立，高 振，張 齊，等. 無(wú)機(jī)碳源對(duì)小球藻自養(yǎng)產(chǎn)油脂的影響[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2011，27(3)：436-444.

[13]田志環(huán)，焦傳珍. 葛仙米研究現(xiàn)狀及其開(kāi)發(fā)前景[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(2)：170-172.

[14]鄧中洋. 葛仙米、地木耳的大量培養(yǎng)及葛仙米形態(tài)生理特征研究[D]. 武漢：中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，2006.

[15]Chen Z，Chen S，Lu G，et al. Phosphorus limitation for the colony formation，growth and photosynthesis of an edible cyanobacterium，Nostocsphaeroides[J]. Biotechnology Letters，2012，34(1)：137-143.

[16]文 靖. 不同鈣濃度對(duì)葛仙米生理生化特性的影響[D]. 武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2014.

[17]張志良，翟偉菁，李小方. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，2009：118-119.

[18]Siegelman H W，Kycia J H. Algal biliproteins[M]//Hellebust J A，Craigie J S. Handbook of phycological methods: physiological and biochemical methods. Cambridge: Cambridge University Press，1978：71-79.

[19]趙旭輝，孔繁翔，謝薇薇，等. 全球CO2水平升高對(duì)浮游植物生理和生態(tài)影響的研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32(21)：6880-6891.

[20]郭 琪，鄭凌凌，沈 偉，等. 不同二氧化碳濃度培養(yǎng)對(duì)兩株?yáng)旁逄脊潭ㄋ俾始坝椭e累的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2016，40(2)：414-418.

[21]劉春光，金相燦，孫 凌，等. pH值對(duì)淡水藻類(lèi)生長(zhǎng)和種類(lèi)變化的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24(2)：294-298.

[22]程 超，莫開(kāi)菊，汪興平. 葛仙米生長(zhǎng)及繁殖條件的探討[J]. 湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，21(4)：14-17.