QuEChERS-高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定飼料中17種霉菌毒素

崔曉娜， 郭禮強(qiáng)， 葛愛(ài)民， 李 舫

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061； 2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041)

通信作者：李 舫，女，碩士，教授，主要從事家禽生產(chǎn)中生物安全控制技術(shù)研究。E-mail：sdmylifang@163.com。

霉菌毒素對(duì)人和動(dòng)物是有害的，是霉菌在被污染的食品或飼料中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，其不僅會(huì)對(duì)糧食、飼料等產(chǎn)生嚴(yán)重的污染，引起人、畜中毒或死亡，而且有些霉菌毒素還具有“三致”作用，嚴(yán)重危害了人畜的健康。霉菌毒素的污染主要來(lái)自于農(nóng)作物、飼料、食品的生產(chǎn)、加工及儲(chǔ)存等各個(gè)環(huán)節(jié)[1-2]。已發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素約有300種[3]，其中只有極少一部分被常規(guī)監(jiān)管及殘留監(jiān)控。因此，評(píng)估和篩查常用霉菌毒素在飼料及農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，對(duì)維護(hù)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展及保護(hù)消費(fèi)者的健康具有積極意義。

目前，在對(duì)多種霉菌毒素同時(shí)檢測(cè)的方法中以液相色譜法[4-5]和液相色譜-質(zhì)譜法[6-9]為常用的檢測(cè)方法，但因其選擇性差，很難對(duì)多種毒素同時(shí)檢測(cè)，且靈敏度也達(dá)不到要求。液相色譜-質(zhì)譜法方法的選擇性好，操作簡(jiǎn)單省時(shí)，尤其是四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜屬于高分辨質(zhì)譜，具有質(zhì)量范圍廣、高通量、高質(zhì)量精度和分辨率、分析全面等優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)毒素準(zhǔn)分子離子的精確分子質(zhì)量對(duì)其進(jìn)行定性推導(dǎo)，顯著提高了復(fù)雜基質(zhì)下的抗干擾能力，而質(zhì)譜獲得的全掃描譜圖可以用于建立化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，因此，可以在不使用標(biāo)準(zhǔn)品的情況下通過(guò)已有數(shù)據(jù)庫(kù)的信息對(duì)未知樣品中的化合物進(jìn)行定性判斷[10-12]。目前，國(guó)內(nèi)利用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜篩查飼料中霉菌毒素的報(bào)道較少，但該方法的開(kāi)發(fā)利用具有良好的應(yīng)用前景。因此，本研究選擇易污染糧谷飼料的常見(jiàn)產(chǎn)毒霉菌代謝物為研究對(duì)象，建立17種霉菌毒素的一級(jí)和二級(jí)譜庫(kù)，并采用QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe，簡(jiǎn)稱(chēng)QuEChERS)前處理提取方法，結(jié)合譜庫(kù)檢索建立飼料中17種霉菌毒素的快速高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC-Q-TOF/MS)測(cè)定方法，以期為企業(yè)及監(jiān)管部門(mén)提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Agilent 1290-6530高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(electrospray ionization，簡(jiǎn)稱(chēng)ESI)，購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；5810R離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；N-EVAP氮吹儀，購(gòu)自美國(guó)Organomation Associates公司；Milli-Q超純水機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；KQ-500超聲波清洗器，購(gòu)自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、橘青霉素、蛇形菌素、新茄鐮孢菌醇、疣孢青霉原標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自BioPure公司；O-甲基雜色曲霉素、雜色曲霉素、環(huán)匹阿尼酸、青霉酸、伏馬菌素(B1、B2)，購(gòu)自Sigma公司。

中性氧化鋁，購(gòu)自杭州永星五交化有限公司；石墨炭黑粉、C18粉、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，簡(jiǎn)稱(chēng)PSA)粉、氨丙基粉，均購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸，均為色譜純，均購(gòu)自德國(guó)Merck公司；試驗(yàn)用水為超純水。

將各標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，各50 mL，存儲(chǔ)期6個(gè)月；再用乙腈配制濃度為 100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品中間液，再根據(jù)實(shí)際需要用飼料提取液稀釋成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃保存，有效期3個(gè)月。

1.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g均質(zhì)的試驗(yàn)樣品置于50 mL離心管內(nèi)，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液(乙腈與水的體積比為 8 ∶2)，高速均質(zhì)1 min，以10 000 r/min離心10 min，取8 mL上清液于15 mL干凈的玻璃試管中，加入500 mg C18粉渦旋振蕩，靜置2 min后，取4 mL上層溶液于10 mL玻璃試管中，30 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，? mL初始流動(dòng)相溶液將其溶解，渦旋振蕩1 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后供HPLC-Q-TOF/MS分析測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B為0.1%乙腈水溶液；梯度洗脫程序：0～2 min，5% B；2～12 min，5%～80% B；12～16 min，80%～95% B；16～17 min，95%～5% B；平衡3 min。進(jìn)樣體積為10 μL，流速為0.3 mL/min。參比質(zhì)荷比范圍為121.050 9～922.009 8。

1.4 質(zhì)譜條件

氣體溫度為350 ℃，干燥氣流量10 L/min，霧化氣壓力為310.26 kPa，電離方式為正離子模式，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存方式為柱狀圖，電壓為4 000 V，碰撞能量為 20 V。17種霉菌毒素的部分質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 17種霉菌毒素的部分質(zhì)譜參數(shù)

1.5 譜庫(kù)建立

配制濃度為1 mg/L的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，在不同碰撞能量(0、10、20、40 V)下分別對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行測(cè)定，采集所需數(shù)據(jù)，建立目標(biāo)化合物一級(jí)質(zhì)譜全掃描篩查庫(kù)和二級(jí)譜圖庫(kù)。通過(guò)譜庫(kù)檢索，以目標(biāo)化合物的一級(jí)質(zhì)譜精確分子量、保留時(shí)間、同位素豐度匹配、特征離子等信息進(jìn)行定性分析，同時(shí)填寫(xiě)分子式和化學(xué)名稱(chēng)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

飼料的基質(zhì)成分較復(fù)雜，提取溶劑的選擇對(duì)霉菌毒素回收率有重要影響。參考相關(guān)文獻(xiàn)，排除毒性較大的四氯化碳、含苯環(huán)溶劑后，本試驗(yàn)先后采用甲醇、乙腈、異丙醇、甲醇水溶液[5]、乙腈水溶液[6-10，13]等5種溶液進(jìn)行提取。結(jié)果表明，僅以甲醇、乙腈、異丙醇為提取溶劑時(shí)，17種霉菌毒素的回收率在15%～45%之間；使用甲醇-水作為提取溶劑時(shí)，回收率在44%～60%之間；使用乙腈-水作為提取溶劑時(shí)，回收率在50%～80%之間，比甲醇-水作為提取溶劑時(shí)的回收率最低提高了6%，且基質(zhì)噪音更低，最終選用乙腈-水作為提取溶劑。同時(shí)考察了提取溶液的pH值對(duì)霉菌毒素回收率的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在提取溶液中加入1%甲酸后，回收率和穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，推測(cè)一些霉菌毒素(伏馬菌素B1、赭曲霉素A等)在中性或堿性環(huán)境下易分解，酸性環(huán)境更有利于提取。為提高凈化效果，提高方法的靈敏度，本試驗(yàn)進(jìn)一步考察了C18粉、石墨炭黑粉、中性氧化鋁、PSA粉、氨丙基粉等5種QuEChERS凈化粉[14-15]對(duì)17種霉菌毒素的吸附回收率，通過(guò)在霉菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(15.0 μg/kg)中添加5種凈化粉，與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比來(lái)計(jì)算吸附率。由表2可知，C18粉對(duì)17種霉菌毒素的吸附影響較低，目標(biāo)分析物的回收率為96.2%～114.5%，其他4種凈化粉對(duì)一些霉菌毒素的吸附較嚴(yán)重，達(dá)不到試驗(yàn)要求。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

對(duì)于飛行時(shí)間質(zhì)譜，相似目標(biāo)分析物基質(zhì)或同分異構(gòu)體對(duì)采集精確分子量數(shù)據(jù)影響較大，干擾譜庫(kù)的檢索，同時(shí)所測(cè)定的17種霉菌毒素母離子質(zhì)荷比在169～723之間(表1)，化學(xué)性質(zhì)相差很大，這些對(duì)色譜條件都提出了一定要求。試驗(yàn)考察了甲醇和乙腈2種有機(jī)流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)分析物的影響，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)，疣孢青霉原的峰形偏寬，靈敏度偏低；黃曲霉毒素B1與黃曲霉毒素B2的保留時(shí)間相差不大，干擾二級(jí)碎片離子分析。調(diào)整流動(dòng)相為乙腈-水[6]，經(jīng)多次試驗(yàn)最終確定了“1.2”節(jié)中所述流動(dòng)相比例及梯度洗脫條件，應(yīng)用該方法時(shí)基線平穩(wěn)，各目標(biāo)物能有效分離，目標(biāo)分析物的一級(jí)、二級(jí)譜圖響應(yīng)值較好。

表2 經(jīng)C18粉、石墨炭黑粉、中性氧化鋁、PSA粉、氨丙基粉等5種凈化粉吸附后17種霉菌毒素的回收率

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

高分辨質(zhì)譜篩查流程簡(jiǎn)單、通量高，非常適合做目標(biāo)分析物和未知樣品的篩查，對(duì)于已知化合物可以通過(guò)其標(biāo)準(zhǔn)品建立化合物的一級(jí)、二級(jí)譜圖庫(kù)，從而在未知樣品質(zhì)譜掃描后提取質(zhì)譜信息，通過(guò)譜圖庫(kù)比對(duì)結(jié)果，直接對(duì)化合物進(jìn)行定性、定量分析，從而提高檢測(cè)者的工作效率。將目標(biāo)化合物分別配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用HPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，以黃曲霉毒素B1(精確質(zhì)荷比為329.065 7)為例，如圖1所示，通過(guò)譜庫(kù)檢索，可以初步推斷化合物的精確分子量、分子式、同位素峰等信息。統(tǒng)計(jì)17種霉菌毒素的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息(表1)，建成質(zhì)譜庫(kù)，包含保留時(shí)間、母離子、子離子、結(jié)構(gòu)式等。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

對(duì)17種霉菌毒素質(zhì)量濃度在1.0～200.0 μg/L之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(用飼料基質(zhì)提取液配制)進(jìn)行測(cè)定，以各目標(biāo)分析物峰面積的平均值(y)與其質(zhì)量濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)均大于0.990(表3)。在飼料基質(zhì)中添加系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以信噪比為3作為方法的檢出限，以信噪比為10作為方法的定量下限。由表3可知，17種霉菌毒素的檢出限為0.5～3.0 μg/kg，定量下限為1.0～10.0 μg/kg 。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的20份飼料(全價(jià)飼料和玉米粉各10份)中的霉菌毒素含量進(jìn)行測(cè)定，在1份玉米粉樣品中檢出黃曲霉毒素B2，含量為4.1 μg/kg。如圖2所示，其中圖2-a為疑似黃曲霉毒素B2提取離子流圖，圖2-b為通過(guò)譜庫(kù)檢索疑似樣品和譜庫(kù)匹配后提供的精確分子量信息，由此推斷為黃曲霉毒素B2。為了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，引用質(zhì)檢總局霉菌毒素行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[16]對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果為 4.3 μg/kg，小于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(5.0 μg/kg)，與篩查檢測(cè)結(jié)果比較吻合。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)使用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜快速篩查了飼料中17種常見(jiàn)霉菌毒素，在無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，通過(guò)譜庫(kù)檢索，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)飼料中17種霉菌毒素的定性、定量分析。通過(guò)對(duì)提取溶劑、QuEChERS凈化粉、色譜質(zhì)譜條件等進(jìn)行優(yōu)化研究，提高了該方法的靈敏度和通用性，可以滿足飼料中常見(jiàn)霉菌毒素殘留檢測(cè)的需求。

表3 17種霉菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限與定量下限

參考文獻(xiàn)：

[1]Binder E M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production[J]. Animal Feed Science & Technology，2007，133(1/2)：149-166.

[2]Bryden W L. Mycotoxin contamination of the feed supply chain：implications for animal productivity and feed security[J]. Animal Feed Science and Technology，2001，83(2)：134-158.

[3]Berthiller F，Sulyok M，Krska R，et al. Chromatographic methods for the simultaneous determination of mycotoxins and their conjugates in cereals[J]. International Journal of Food Microbiology，2007，119(1/2)：33-37.

[4]Trucksess M W，Scott P M. Mycotoxins in botanicals and dried fruits：a review[J]. Food Additives & Contaminants. Part A，Chemistry，Analysis，Control，Exposure & Risk Assessment，2008，25(2)：181-192.

[5]鄭 榮，毛 丹，王少敏，等. 11種中藥材中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的HPLC法測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41(5)：368-372.

[6]Varga E G T，Glauner T，Berthiller F. Development and validation of a (semi-)quantitative UHPLC-MS/MS method for the determination of 191 mycotoxins and other fungal metabolites in almonds，hazelnuts，Peanuts and pistachios[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2013，405(15)：5087-5104.

[7]Streit E，Schwab C，Sulyok M，et al. Multi-Mycotoxin screening reveals the occurrence of 139 different secondary metabolites in feed and feed ingredients[J]. Toxins，2013，5(3)：504-523.

[8]Storm I M，Rasmussen R R，Rasmussen P H. Occurrence of pre-and post-harvest mycotoxins and other secondary metabolites in Danish maize silage[J]. Toxins，2014，6(8)：2256-2269.

[9]Warth B，Parich A，Atehnkeng J，et al. Quantitation of mycotoxins in food and feed from Burkina Faso and Mozambique using a modern LC-MS/MS multitoxin method[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2012，60(36)：9352-9363.

[10]余 璐，宋 偉，呂亞寧，等. 超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法快速篩查茶葉中的204種農(nóng)藥殘留[J]. 色譜，2015，33(6)：597-612.

[11]彭 興，趙志遠(yuǎn)，康 健，等. LC-TOF/MS無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品定性篩查水果蔬菜中210種農(nóng)藥殘留[J]. 分析試驗(yàn)室，2014，33(3)：282-291.

[12]趙志遠(yuǎn)，石志紅，康 健，等. 液相色譜-四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜快速篩查與確證蘋(píng)果、番茄和甘藍(lán)中的281種農(nóng)藥殘留量[J]. 色譜，2013，31(4)：372-379.

[13]盂 娟，張 晶，張 楠，等. 固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)糧食及其制品中的玉米赤霉烯酮類(lèi)真菌毒素[J]. 色譜，2010，28(6)：601-607.

[14]王連珠，黃小燕，陳 泳，等. QuEChERS前處理-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定果蔬中18種弱酸性農(nóng)藥殘留[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2014，33(10)：1102-1108.

[15]李 靜，張 鴻，柴之芳，等. 分散固相萃取結(jié)合HPLC-MS/MS檢測(cè)雞蛋中16種全氟化合物[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2014，33(10)：1109-1115.

[16]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.出口花生、谷類(lèi)及其制品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的測(cè)定：SN/T 3136—2012[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.