QuEChERS-高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜同時測定飼料中17種霉菌毒素

崔曉娜， 郭禮強， 葛愛民， 李 舫

(1.山東畜牧獸醫職業學院，山東濰坊 261061； 2.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041)

通信作者：李 舫，女，碩士，教授，主要從事家禽生產中生物安全控制技術研究。E-mail：sdmylifang@163.com。

霉菌毒素對人和動物是有害的，是霉菌在被污染的食品或飼料中產生的有毒代謝產物，其不僅會對糧食、飼料等產生嚴重的污染，引起人、畜中毒或死亡，而且有些霉菌毒素還具有“三致”作用，嚴重危害了人畜的健康。霉菌毒素的污染主要來自于農作物、飼料、食品的生產、加工及儲存等各個環節[1-2]。已發現的霉菌毒素約有300種[3]，其中只有極少一部分被常規監管及殘留監控。因此，評估和篩查常用霉菌毒素在飼料及農產品中的殘留，對維護畜牧養殖業的健康發展及保護消費者的健康具有積極意義。

目前，在對多種霉菌毒素同時檢測的方法中以液相色譜法[4-5]和液相色譜-質譜法[6-9]為常用的檢測方法，但因其選擇性差，很難對多種毒素同時檢測，且靈敏度也達不到要求。液相色譜-質譜法方法的選擇性好，操作簡單省時，尤其是四極桿-飛行時間質譜屬于高分辨質譜，具有質量范圍廣、高通量、高質量精度和分辨率、分析全面等優點，可根據毒素準分子離子的精確分子質量對其進行定性推導，顯著提高了復雜基質下的抗干擾能力，而質譜獲得的全掃描譜圖可以用于建立化合物質譜數據庫，因此，可以在不使用標準品的情況下通過已有數據庫的信息對未知樣品中的化合物進行定性判斷[10-12]。目前，國內利用高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜篩查飼料中霉菌毒素的報道較少，但該方法的開發利用具有良好的應用前景。因此，本研究選擇易污染糧谷飼料的常見產毒霉菌代謝物為研究對象，建立17種霉菌毒素的一級和二級譜庫，并采用QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe，簡稱QuEChERS)前處理提取方法，結合譜庫檢索建立飼料中17種霉菌毒素的快速高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，簡稱HPLC-Q-TOF/MS)測定方法，以期為企業及監管部門提供有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Agilent 1290-6530高效液相色譜-飛行時間質譜儀，配電噴霧離子源(electrospray ionization，簡稱ESI)，購自美國Agilent公司；5810R離心機，購自德國Eppendorf公司；N-EVAP氮吹儀，購自美國Organomation Associates公司；Milli-Q超純水機，購自美國Millipore公司；KQ-500超聲波清洗器，購自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、橘青霉素、蛇形菌素、新茄鐮孢菌醇、疣孢青霉原標準品，均購自BioPure公司；O-甲基雜色曲霉素、雜色曲霉素、環匹阿尼酸、青霉酸、伏馬菌素(B1、B2)，購自Sigma公司。

中性氧化鋁，購自杭州永星五交化有限公司；石墨炭黑粉、C18粉、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，簡稱PSA)粉、氨丙基粉，均購自美國Agilent公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸，均為色譜純，均購自德國Merck公司；試驗用水為超純水。

將各標準品用乙腈溶解，配成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液，各50 mL，存儲期6個月；再用乙腈配制濃度為 100 μg/L 的標準品中間液，再根據實際需要用飼料提取液稀釋成合適濃度的混合標準工作液，于4 ℃保存，有效期3個月。

1.2 樣品處理

準確稱取5.0 g均質的試驗樣品置于50 mL離心管內，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液(乙腈與水的體積比為 8 ∶2)，高速均質1 min，以10 000 r/min離心10 min，取8 mL上清液于15 mL干凈的玻璃試管中，加入500 mg C18粉渦旋振蕩，靜置2 min后，取4 mL上層溶液于10 mL玻璃試管中，30 ℃水浴氮氣吹干，用1 mL初始流動相溶液將其溶解，渦旋振蕩1 min，經0.22 μm濾膜過濾后供HPLC-Q-TOF/MS分析測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為0.1%乙腈水溶液；梯度洗脫程序：0～2 min，5% B；2～12 min，5%～80% B；12～16 min，80%～95% B；16～17 min，95%～5% B；平衡3 min。進樣體積為10 μL，流速為0.3 mL/min。參比質荷比范圍為121.050 9～922.009 8。

1.4 質譜條件

氣體溫度為350 ℃，干燥氣流量10 L/min，霧化氣壓力為310.26 kPa，電離方式為正離子模式，采用多反應監測模式采集，數據儲存方式為柱狀圖，電壓為4 000 V，碰撞能量為 20 V。17種霉菌毒素的部分質譜參數如表1所示。

表1 17種霉菌毒素的部分質譜參數

1.5 譜庫建立

配制濃度為1 mg/L的霉菌毒素標準品，在不同碰撞能量(0、10、20、40 V)下分別對目標化合物進行測定，采集所需數據，建立目標化合物一級質譜全掃描篩查庫和二級譜圖庫。通過譜庫檢索，以目標化合物的一級質譜精確分子量、保留時間、同位素豐度匹配、特征離子等信息進行定性分析，同時填寫分子式和化學名稱等。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

飼料的基質成分較復雜，提取溶劑的選擇對霉菌毒素回收率有重要影響。參考相關文獻，排除毒性較大的四氯化碳、含苯環溶劑后，本試驗先后采用甲醇、乙腈、異丙醇、甲醇水溶液[5]、乙腈水溶液[6-10，13]等5種溶液進行提取。結果表明，僅以甲醇、乙腈、異丙醇為提取溶劑時，17種霉菌毒素的回收率在15%～45%之間；使用甲醇-水作為提取溶劑時，回收率在44%～60%之間；使用乙腈-水作為提取溶劑時，回收率在50%～80%之間，比甲醇-水作為提取溶劑時的回收率最低提高了6%，且基質噪音更低，最終選用乙腈-水作為提取溶劑。同時考察了提取溶液的pH值對霉菌毒素回收率的影響，試驗發現在提取溶液中加入1%甲酸后，回收率和穩定性進一步提高，推測一些霉菌毒素(伏馬菌素B1、赭曲霉素A等)在中性或堿性環境下易分解，酸性環境更有利于提取。為提高凈化效果，提高方法的靈敏度，本試驗進一步考察了C18粉、石墨炭黑粉、中性氧化鋁、PSA粉、氨丙基粉等5種QuEChERS凈化粉[14-15]對17種霉菌毒素的吸附回收率，通過在霉菌毒素混合標準溶液(15.0 μg/kg)中添加5種凈化粉，與混合標準溶液對比來計算吸附率。由表2可知，C18粉對17種霉菌毒素的吸附影響較低，目標分析物的回收率為96.2%～114.5%，其他4種凈化粉對一些霉菌毒素的吸附較嚴重，達不到試驗要求。

2.2 色譜條件的優化

對于飛行時間質譜，相似目標分析物基質或同分異構體對采集精確分子量數據影響較大，干擾譜庫的檢索，同時所測定的17種霉菌毒素母離子質荷比在169～723之間(表1)，化學性質相差很大，這些對色譜條件都提出了一定要求。試驗考察了甲醇和乙腈2種有機流動相對目標分析物的影響，發現流動相為甲醇-水時，疣孢青霉原的峰形偏寬，靈敏度偏低；黃曲霉毒素B1與黃曲霉毒素B2的保留時間相差不大，干擾二級碎片離子分析。調整流動相為乙腈-水[6]，經多次試驗最終確定了“1.2”節中所述流動相比例及梯度洗脫條件，應用該方法時基線平穩，各目標物能有效分離，目標分析物的一級、二級譜圖響應值較好。

表2 經C18粉、石墨炭黑粉、中性氧化鋁、PSA粉、氨丙基粉等5種凈化粉吸附后17種霉菌毒素的回收率

2.3 質譜條件的優化

高分辨質譜篩查流程簡單、通量高，非常適合做目標分析物和未知樣品的篩查，對于已知化合物可以通過其標準品建立化合物的一級、二級譜圖庫，從而在未知樣品質譜掃描后提取質譜信息，通過譜圖庫比對結果，直接對化合物進行定性、定量分析，從而提高檢測者的工作效率。將目標化合物分別配制成質量濃度為10 mg/L的標準溶液。采用HPLC-Q-TOF/MS進行質譜數據的采集，以黃曲霉毒素B1(精確質荷比為329.065 7)為例，如圖1所示，通過譜庫檢索，可以初步推斷化合物的精確分子量、分子式、同位素峰等信息。統計17種霉菌毒素的保留時間和質譜信息(表1)，建成質譜庫，包含保留時間、母離子、子離子、結構式等。

2.4 線性關系、檢出限與定量下限

對17種霉菌毒素質量濃度在1.0～200.0 μg/L之間的系列混合標準溶液(用飼料基質提取液配制)進行測定，以各目標分析物峰面積的平均值(y)與其質量濃度(x)繪制標準曲線，其相關系數均大于0.990(表3)。在飼料基質中添加系列濃度的混合標準物質，以信噪比為3作為方法的檢出限，以信噪比為10作為方法的定量下限。由表3可知，17種霉菌毒素的檢出限為0.5～3.0 μg/kg，定量下限為1.0～10.0 μg/kg 。

2.5 實際樣品的測定

對市場購買的20份飼料(全價飼料和玉米粉各10份)中的霉菌毒素含量進行測定，在1份玉米粉樣品中檢出黃曲霉毒素B2，含量為4.1 μg/kg。如圖2所示，其中圖2-a為疑似黃曲霉毒素B2提取離子流圖，圖2-b為通過譜庫檢索疑似樣品和譜庫匹配后提供的精確分子量信息，由此推斷為黃曲霉毒素B2。為了檢驗結果的準確性，引用質檢總局霉菌毒素行業標準[16]對陽性樣品進行驗證，檢測結果為 4.3 μg/kg，小于國家標準(5.0 μg/kg)，與篩查檢測結果比較吻合。

3 結論

本試驗使用QuEChERS前處理技術結合液相色譜-飛行時間質譜快速篩查了飼料中17種常見霉菌毒素，在無需標準品的情況下，通過譜庫檢索，能夠同時實現對飼料中17種霉菌毒素的定性、定量分析。通過對提取溶劑、QuEChERS凈化粉、色譜質譜條件等進行優化研究，提高了該方法的靈敏度和通用性，可以滿足飼料中常見霉菌毒素殘留檢測的需求。

表3 17種霉菌毒素的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限與定量下限

參考文獻：

[1]Binder E M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production[J]. Animal Feed Science & Technology，2007，133(1/2)：149-166.

[2]Bryden W L. Mycotoxin contamination of the feed supply chain：implications for animal productivity and feed security[J]. Animal Feed Science and Technology，2001，83(2)：134-158.

[3]Berthiller F，Sulyok M，Krska R，et al. Chromatographic methods for the simultaneous determination of mycotoxins and their conjugates in cereals[J]. International Journal of Food Microbiology，2007，119(1/2)：33-37.

[4]Trucksess M W，Scott P M. Mycotoxins in botanicals and dried fruits：a review[J]. Food Additives & Contaminants. Part A，Chemistry，Analysis，Control，Exposure & Risk Assessment，2008，25(2)：181-192.

[5]鄭 榮，毛 丹，王少敏，等. 11種中藥材中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的HPLC法測定[J]. 中國醫藥工業雜志，2010，41(5)：368-372.

[6]Varga E G T，Glauner T，Berthiller F. Development and validation of a (semi-)quantitative UHPLC-MS/MS method for the determination of 191 mycotoxins and other fungal metabolites in almonds，hazelnuts，Peanuts and pistachios[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2013，405(15)：5087-5104.

[7]Streit E，Schwab C，Sulyok M，et al. Multi-Mycotoxin screening reveals the occurrence of 139 different secondary metabolites in feed and feed ingredients[J]. Toxins，2013，5(3)：504-523.

[8]Storm I M，Rasmussen R R，Rasmussen P H. Occurrence of pre-and post-harvest mycotoxins and other secondary metabolites in Danish maize silage[J]. Toxins，2014，6(8)：2256-2269.

[9]Warth B，Parich A，Atehnkeng J，et al. Quantitation of mycotoxins in food and feed from Burkina Faso and Mozambique using a modern LC-MS/MS multitoxin method[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2012，60(36)：9352-9363.

[10]余 璐，宋 偉，呂亞寧，等. 超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法快速篩查茶葉中的204種農藥殘留[J]. 色譜，2015，33(6)：597-612.

[11]彭 興，趙志遠，康 健，等. LC-TOF/MS無標準品定性篩查水果蔬菜中210種農藥殘留[J]. 分析試驗室，2014，33(3)：282-291.

[12]趙志遠，石志紅，康 健，等. 液相色譜-四極桿/飛行時間質譜快速篩查與確證蘋果、番茄和甘藍中的281種農藥殘留量[J]. 色譜，2013，31(4)：372-379.

[13]盂 娟，張 晶，張 楠，等. 固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測糧食及其制品中的玉米赤霉烯酮類真菌毒素[J]. 色譜，2010，28(6)：601-607.

[14]王連珠，黃小燕，陳 泳，等. QuEChERS前處理-液相色譜-串聯質譜測定果蔬中18種弱酸性農藥殘留[J]. 分析測試學報，2014，33(10)：1102-1108.

[15]李 靜，張 鴻，柴之芳，等. 分散固相萃取結合HPLC-MS/MS檢測雞蛋中16種全氟化合物[J]. 分析測試學報，2014，33(10)：1109-1115.

[16]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.出口花生、谷類及其制品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的測定：SN/T 3136—2012[S]. 北京：中國標準出版社，2012.