微生物法生產甘油酸發酵培養基的優化

姚浩軻， 方亞坤， 周 配， 劉宇鵬， 張海燕

(河南大學生命科學學院，河南開封 475004)

通信作者：張海燕，博士，副教授，主要從事生物工程研究。E-mail：zhanghy150@sina.com。

隨著各方面技術的發展，生物柴油作為可替代的能源已經開始應用于生活的各個方面，然而在生物柴油生產的過程中會有10%左右的副產物甘油[1]。甘油是含有多個羥基的三碳化合物，是甘油三酯的骨架成分。甘油在很多方面具有重要的用途，例如化妝方面甘油可以作為保濕劑，在食品和藥品方面可以作為添加劑。同時，甘油在涂料、汽車、煙草和紡織方面也具有重要的作用[2]。然而由于生物柴油的大量生產致使甘油的價格出現很大的波動，這也使得許多化學和生物方面的研究者須要付出更多的努力來探索將甘油轉化成具有更高價值的化學物質[3-4]，其中氧化甘油生產甘油酸(2，3-二羥基丙酸)就是一條重要的途徑。甘油酸是一種三碳有機酸，作為一種化學成分存在于自然界的大部分植物體內，同時在人體內也存在甘油酸的衍生物。甘油酸在食品和醫藥行業具有重要的作用[5]，例如，作為添加劑添加在食品中可以改善食品的口感；由于甘油酸的生物可降解性優于其他高聚物，因此可以用于藥物的運輸載體；并且D-甘油酸能使人體內胃部細胞在受到乙醇刺激后增強活力，從而促進乙醇分解代謝，因此可以作為解酒藥的成分[6]。

據報道，甘油酸和甘油酸衍生物也具有重要的生物學活性[7]。例如在狗體內的甘油酸具有增加膽固醇活性和使肝興奮的功能，甘油酸衍生出的酯類低聚物具有抗胰蛋白酶活性[8]。因此，采用微生物轉化甘油來生產甘油酸既可充分利用生物柴油生產過程中的廢棄物，同時又具有很大的市場潛力。本研究采用微生物轉化法轉化甘油生產甘油酸，該方法具有環境溫和、產量高、方法簡便、產物具有立體選擇性等優點。本研究對甘油酸發酵培養基成分進行單因素試驗，然后利用正交設計試驗來確定最佳的培養基成分。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

1.1.1 菌株 葡萄糖酸桿菌(Gluconobacterjaponicus)CGMCC12425，由筆者所在實驗室從腐爛的水果中分離獲得，現保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養基 (1)種子培養基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值6.5～7.0。(2)初始發酵培養基：甘油15.00%、蛋白胨0.90%、酵母粉0.10%、K2HPO40.01%、KH2PO40.09%、MgSO4·7H2O 0.10%、CaCO32.00%，pH值6.5～7.0。(3)優化后發酵培養基：甘油14.087 0%、蛋白胨 0.959 0%、硫酸錳0.051 2%、KH2PO40.090 0%、K2HPO40.010 0%、CaCO32.000%，pH值6.5～7.0。上述培養基中種子培養基是在115 ℃下滅菌 30 min，發酵培養基在121 ℃下滅菌30 min。每個試驗作3個平行樣，取平均值并計算誤差。

1.2 方法

1.2.1 培養條件 種子培養條件：30 ℃、200 r/min，裝液量30 mL/250 mL，恒溫搖床培養24 h。發酵培養條件：30 ℃、220 r/min，裝液量30 mL/250 mL，恒溫搖床培養3 d，每個試驗作3個平行樣，取平均值并計算誤差。

1.2.2 檢測方法 采用HPLC法測定發酵液中甘油酸、二羥基丙酮、甘油的含量[9-10]。檢測條件：1515泵、2489紫外檢測器(檢測波長 210 nm)、2414示差檢測器、1500柱溫箱、2707自動進樣器。色譜柱型號Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)；柱溫60 ℃；流動相5 mmol/L H2SO4和20%乙腈；流速0.3 mL/min；進樣量20 μL。

1.2.3 響應面分析 使用SAS 8.0軟件進行發酵培養基的優化。

2 結果與分析

2.1 不同pH值對發酵結果的影響

甘油酸是一種三碳有機酸，在發酵過程中產生甘油酸會導致發酵液的pH值偏低，從而影響菌體的生長及酶活性，進而影響甘油酸的產生。本試驗采用在發酵液中添加碳酸鈣和堿式碳酸鎂來調節發酵液中的pH值，使pH值的范圍控制在5.0左右，對照組不作任何處理。碳酸鈣和堿式碳酸鎂的添加量為20 g/L，按照“1.2.1”節的培養方式進行培養，按照“1.2.2”節對發酵結果進行檢測，結果如圖1所示。

從圖1可以看出，與對照組相比當發酵液中添加堿式碳酸鎂時甘油酸和二羥基丙酮(DHA)幾乎不產生，然而當添加碳酸鈣來調節發酵液的pH值時，發現甘油酸產量增加，此時甘油酸的產量可達37.62 g/L，說明在試驗過程中添加碳酸鈣可以促進產物的產生。因此，在以下試驗中選擇碳酸鈣調節發酵液的pH值。

2.2 不同超始甘油濃度對發酵結果的影響

高的甘油濃度會抑制菌體的生長，但同時也可以抑制副產物DHA的產生。本試驗探索不同起始甘油濃度對發酵結果的影響，選出最佳的甘油濃度。試驗過程中選取的起始甘油濃度梯度為50、100、150、200、250 g/L，發酵培養基的其他成分保持不變，按照“1.2.1”節的培養方式進行培養，按照“1.2.2”節對發酵結果進行檢測，試驗結果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著起始甘油濃度的增加，甘油酸產量先增加后減少，在起始甘油濃度為150 g/L時甘油酸的產量達到最大，此時甘油酸的產量為42.33 g/L。并且此時副產物DHA的產量也相對較小，當甘油濃度超過150 g/L后甘油酸的產量開始下降，達到250 g/L時甘油酸幾乎不再產生，可能是由于較高的甘油濃度在抑制副產物產生時更抑制了菌體的生長。因此，選擇150 g/L起始甘油濃度為最佳的濃度。

2.3 不同氮源種類對發酵結果的影響

本研究分別選取牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米漿、酵母膏、硫酸銨、硝酸鈉和尿素為氮源，以酵母粉和蛋白胨混合氮源為對照組，保持發酵培養基中含氮量一致，其他成分不變，按照“1.2.1”節的培養方式進行培養，按照“1.2.2”節對發酵結果進行檢測，試驗結果如圖3所示。

從圖3可以看出，與有機氮源相比添加無機氮源會更有利于產物的產生，主要因為菌體對無機氮源的利用較差，在僅含有無機氮源的培養基中菌體幾乎不生長(數據未列出)。然而與對照組相比在保證氮含量一致的情況下添加蛋白胨更利于產物甘油酸的產生，同時與對照相比副產物的產量也有所下降，此時甘油酸的產量最高，可以達到43.53 g/L。說明蛋白胨更易于被菌體利用，更易于產物的產生。

2.4 不同金屬離子對發酵結果的影響

金屬離子可以影響不同酶的活性，從而影響產物的產生，本試驗分別選取硫酸鋅、硫酸鐵、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鎂為金屬離子，以不添加金屬離子的空白發酵液為對照組，金屬離子的添加量為1 g/L，其他成分保持不變，按照 “1.2.1” 節的培養方式進行培養，按照“1.2.2”節對發酵結果進行檢測，結果如圖4所示。

從圖4可以看出，當添加金屬離子時某些金屬離子會促進產物的產生，其中Mn2+可以促進產物甘油酸的產生。可能是由于Mn2+更易于提高醇脫氫酶和醛脫氫酶的活性。此時甘油酸的產量最高，可以達到45.25 g/L。

2.5 響應面法優化發酵培養基

通過單因素及正交試驗(數據未列出)發現，甘油、蛋白胨、硫酸錳濃度對甘油酸的產量有明顯影響，為研究這些因素之間的相互作用，設計響應面分析試驗，考察甘油、蛋白胨漿、硫酸錳濃度對甘油酸發酵的影響，優選3個主要因素的適宜濃度范圍。以甘油、蛋白胨、硫酸錳濃度3個因素為自變量，以甘油酸濃度為響應值，設計3個因素3個水平試驗，培養基其他因素不變，培養基濃度及編碼設置見表1。

表1 響應面法優化發酵培養基試驗因素和水平

采用Box-Behnken中心組合設計，分別進行15組試驗，結果見表2。用Design-Expert 8.0統計分析軟件進行多元回歸分析，主要分析結果見表3。由表3可看出，X1、X12、X22、X2X3、X32影響顯著(P<0.05)，其他二次項及交互項的影響并不顯著(P>0.05)。經過回歸擬合后，各因子對響應值的影響可以用回歸方程表示為Y=50.780 0-4.330 0X1-0.787 5X2+0.675 0X3-11.533 8X12-1.027 5X1X2+0.907 5X1X3-3.143 8X22+2.257 5X2X3-4.118 8X32。式中：Y表示甘油酸含量(g/L)。

表2 響應面法優化發酵培養基試驗方案與結果

表3 回歸方程的方差分析

該擬合方程的回歸系數高達0.992 9，說明該模型適用于甘油酸產量高低的理論預測。根據上述回歸方程描繪出響應面分析圖及等高線圖(圖5)以確認甘油、蛋白胨、硫酸錳濃度對甘油酸含量的影響。隨著甘油、蛋白胨、硫酸錳濃度的增加，甘油酸的產量也增加，達到一定值后甘油酸的產量不再增加，因此可以找出3種濃度的最佳組合。3種因素對甘油酸產量影響的順序分別為甘油濃度>蛋白胨濃度>硫酸錳濃度。

利用SAS軟件進行脊嶺分析，進一步研究3個因素的最佳濃度。通過分析可得出，回歸模型存在最大值點，此時甘油酸的產量最高，可達51.22 g/L。3個因素的取值分別為甘油濃度：140.870 g/L；蛋白胨濃度：9.590 g/L；硫酸錳濃度：0.512 g/L。

按照響應面優化后的培養基組合進行重復驗證試驗，試驗進行5個平行樣，最后得到的甘油酸的平均產量為 51.360 g/L，比優化前(37.620 g/L)提高36.52%，與響應面預測的極值基本符合。

3 結論

目前，國外甘油酸微生物法生產的報道較多的菌株普遍是葡糖桿菌屬的菌株，例如弗拉多葡萄糖酸桿菌(G.frateurii)、弱氧化葡萄糖酸桿菌(G.suboxydans)、氧化葡萄糖酸桿菌 (G.oxydans)等， 然而國內尚未有微生物法生產甘油

酸的報道，本試驗利用篩選出的新菌株日本葡萄糖酸桿菌CGMCC12425氧化甘油生產甘油酸。通過單因素試驗和正交設計試驗確定對發酵影響相對較大的因素，然后利用響應面分析法確定發酵培養基的最佳配方為：甘油140.870 g/L、蛋白胨9.590 g/L、硫酸錳 0.512 g/L、KH2PO40.900 g/L、K2HPO40.100 g/L、CaCO320.000 g/L、pH值6.5～7.0，優化后比優化前甘油酸的產量增加36.52%。

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