疏肝清脂法干預PI3K/Akt信號通路在動脈粥樣硬化中的分子機制研究

張 歡，于 睿

（遼寧中醫藥大學， 沈陽 110847）

動脈粥樣硬化（AS）是一種嚴重危害人類健康的常見病，是冠心病、血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎。脂質代謝異常是AS的獨立危險因素。調控血脂代謝，也是防治AS的前提[1-3]。脂質代謝異常是通過損害血管壁內皮細胞結構和功能，發生血管內皮細胞損傷、炎癥反應而導致AS的發生，改善脂質代謝，恢復血管內皮功能，防止炎癥細胞黏附，抑制血管平滑肌細胞（VSMC）增殖和遷移，在AS的發生和發展中起著極為重要的作用。人口老齡化社會進程的加速，心腦血管疾病的發病率亦不斷升高。我國每年因心腦血管疾病死亡的人數約有400萬，占總病死率41%，在我國60歲以上人群中發病率高達79.9%。心腦血管疾病不僅給人們的生命健康構成重大威脅，也給社會帶來沉重的經濟負擔。所以，AS發生機制的研究具有重要的社會意義和應用價值。

1 中醫對本病的認識

中醫學認為，動脈粥樣硬化屬“胸痹”“眩暈”“癡呆”“中風”等范疇，其主要發生機制與氣滯、痰濁、血瘀有關，尤其是肝失疏泄，氣機郁滯。《血證論·臟腑病機論》云：“木之性主于疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，而水谷乃化；設肝之清陽不升，則不能疏泄水谷，滲泄中滿之證，在所不免”，《血證論》云：“以肝屬木，木氣沖和條達，不致遏郁，則血脈通暢”， 所以肝失疏泄，氣機郁滯是引發本病的常見原因。肝失疏泄也可以導致膽汁分泌排泄功能障礙，從而影響膽固醇的排出，使血脂代謝失常，故治療當以疏肝清脂為主。在生理上，心主血脈，肝藏血，主疏泄，二者共同調節血液在血脈中運行；在經絡循行上，肝同心包絡同屬厥陰經，有經絡相連接，肝失疏泄，氣滯血瘀，血脈瘀阻而致胸痹的發生。正如《素問·藏氣法時論篇》云：“心病者，胸中痛，脅支滿，脅下痛，膺背肩胛間痛，兩臂內痛。”《靈樞·厥病》篇載：“厥心痛，色蒼蒼如死狀，終日不得太息，肝心痛也”。《薛氏醫案》云：“凡心臟得病，必先調其肝”。在臨床上從肝論治胸痹往往可收到較好的效果。

臨床實踐表明，AS日久常出現胸悶、胸痛、眩暈等氣滯血瘀癥狀，故改善AS當以疏肝理氣為主。《難經》第十難有云：“心脈急甚者，肝邪干心也”。沈金傲的《雜病源流犀燭·心病源流》提出，七情除“喜之氣能散外，余皆足令心氣郁結而為痛也”，故運用疏肝理氣，清脂通脈為主治療，符合中醫從整體出發，治人勝于治病及留人治病的理論。也有醫家認為久病及脾腎，重視健脾補腎法，結合疏肝、豁痰、祛瘀等，但終歸以疏肝清脂為其治療之本。實驗研究表明，自擬方疏肝清脂顆粒可改善血脂代謝，防治AS，減輕西藥降脂藥物引起的不良反應。基于數據挖掘技術，梳理分析古代和近現代文獻，在各醫家從脾論治AS基礎上，創新性提出了“從肝論治”“以絡論治”動脈粥樣硬化消退斑塊的理論。深入研究疏肝清脂法防治動脈粥樣硬化消退斑塊的機制，從基質金屬蛋白酶表達的CD40/CD40L信號傳導的機制研究到干預NPC1L1表達抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的研究和代謝組學研究，證實“疏肝清脂法”能有效防治AS，穩定斑塊，消退AS。從中醫學整體觀念的角度，我們思考疏肝清脂所發揮作用的本質，借助現代醫學信號轉導網絡研究策略，采用現代分子生物技術研究整體觀大背景之下的生物分子之間的相互作用及其傳遞規律。

2 現代醫學對本病分子機制的認識

AS的分子機制復雜，主要涉及膽固醇浸潤、炎癥介質反應、內皮功能紊亂、免疫失調、氧化應激、血小板活化等。近年發現，AS與VSMC發生增殖和遷移密切相關。VSMC的增殖和遷移過程中有巨噬細胞自噬的趨勢。脂質代謝異常能通過誘發巨噬細胞自噬引起VSMC的增殖和遷移，導致AS的發生[4]。

2.1 VSMC增殖和遷移與AS密切相關 VSMC是維持血管張力和功能的主要細胞成分，其由分化表型轉化為去分化表型，并隨之出現的增殖和遷移是AS等心血管疾病的病理生理學基礎[3]。AS的VSMC增殖和遷移過程涉及巨噬細胞的自體吞噬、細胞外基質的降解和蛋白分子標志物的改變，如巨噬細胞的標志物，肌動蛋白抑制蛋白-1（PFN1）、微管相關蛋白輕鏈 3（LC3）、脂聯素（Adp）等表達上調，Atgl2和泛素樣蛋白Atg5、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等表達下調，其中重要的標志性變化是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達減少， VSMC標志物基質金屬蛋白酶 （MMP-2和MMP-9）表達減少；另外，核轉錄因子（NF-KB）及基質金屬蛋白家族在VSMC轉化中也發揮重要作用[5-6]。

2.2 PI3K/Akt信號轉導通路參與AS的發生發展 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路是影響AS的諸多因素激發胞內信號的匯聚點。研究[7-8]證明，PI3K/Akt 信號轉導通路主要通過以下途徑抗AS：1）轉化生長因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長因子（EGF）、人類生長因子（HGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、NF-KB、MMP-2和MMP-9等是VSMC內 PI3K/Akt 信號最重要細胞因子。TGF-β可以與相應受體結合，通過激活 PI3K/Akt 信號通路，可促進細胞外基質的合成與分泌，調節 MMP 的含量與活性，促進細胞外基質的合成與分泌，在斑塊形成、發展和破裂過程中起著重要的作用。2）PI3K/Akt 信號上調細胞內NF-KB等核轉錄因子的表達，直接抑制VSMC增殖；3）PI3K/Akt 信號誘導MMP-2和MMP-9表達，影響斑塊的形成和進展。

PI3K/Ak信號通路可通過調節VSMC增殖、遷移及細胞凋亡影響AS病變發生發展。PI3K是一類特異性磷酸酰肌醇磷脂3位羥基激酶，具有脂類激酶和蛋白激酶的活性[9]。Akt是PI3K信號轉導途徑中一個重要的下游靶激酶，具有絲/蘇氨酸激酶活性，可在PI3K作用下生成磷酸化Akt（pAkt）而激活，pAkt又進一步激活下游因子發揮作用。研究表明PI3K/Akt信號通路廣泛參與了AS的形成過程，包括VSMC增生、病理性新生血管生成、炎癥細胞聚集等，促進AS的發生與發展。研究發現，PDGF在VSMC表型轉換中起主要作用，而PDGF誘導的VSMC增殖與PI3K活性減弱相關。抑制 PI3K /Akt /mTOR 信號通路能誘導巨噬細胞自噬，減少斑塊巨噬細胞的浸潤，抑制炎癥反應進而穩定AS易損斑塊[10]。

3 清脂通脈顆粒對AS兔血脂、炎癥因子及 PI3K/AKT 信號通路的影響

有關中醫藥與PI3K/Akt信號通路之間聯系的研究較少。目前鮮有疏肝清脂法通過調控PI3K/Akt信號通路而啟動VSMC增殖與遷移來抗AS的報道。在前期項目“從肝論治動脈粥樣硬化的機制及內脂素基因表達的實驗研究”中，運用疏肝解郁、平肝清脂之法，應用中藥適度干預而抑制VSMC增殖，減少AS斑塊內的脂質，延緩或消退AS，相對增加斑塊內的膠原含量，達到穩定斑塊的的作用。同時前期進行了疏肝清脂顆粒消退動脈硬化斑塊的有效性、安全性評價研究，重點研究了疏肝清脂藥物藥效學、穩定性、毒性、質量標準，并在動物藥理毒理前期研究基礎上，深入研究疏肝清脂顆粒對消退、穩定動脈粥樣硬化斑塊的機制。

對清脂通脈顆粒抗AS的前期研究及在此基礎上提出工作設想：既然PI3K/Akt信號轉導通路是VSMC中最為活躍的細胞途徑之一[11-13]，激活后能啟動VSMC增殖與遷移，而啟動VSMC增殖是抗AS的機制之一，那么清脂通脈顆粒是否會通過調控PI3K/Akt信號通路抑制VSMC增殖與遷移而起到抗AS的作用。筆者在動物藥理毒理前期研究基礎上，建立新西蘭大耳白兔高脂血癥模型，進一步探討疏肝清脂法對消退、穩定AS斑塊的機制研究。結果證明：疏肝清脂顆粒可明顯降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，降低MMP-2，MMP-9活性，降低CD40/CD40L活性，升高TIMP-2活性，消退AS斑塊。研究證實，疏肝清脂顆粒通過降低血脂，減少脂代謝異常對血管壁內皮細胞結構和功能的損害，恢復血管內皮功能，防止炎性細胞黏附，抑制VSMC增殖和遷移，減少細胞外基質產生，有效降低血脂后，改善血管內皮功能紊亂，進而穩定斑塊，防止其破裂，使AS發生和發展受到抑制，豐富和發展了防治血脂異常和動脈粥樣硬化的理法方藥[14-17]。

因此提出假說：“清脂通脈顆粒可能通過干預PI3K/AKT 信號通路的活性，抑制VSMC增殖與遷移，延緩AS的形成及進展。”研究結果可能部分揭示“肝主疏泄”的本質，同時為豐富AS的病機與治法理論提供新的思路與方法。

4 小結

綜上所述，疏肝清脂顆粒通過干預PI3K/Akt信號通路抑制VSMC增殖和遷移影響AS的機制研究具有重要的科學意義。本項目擬從該通路調節機制切入，探究疏肝清脂顆粒與AS PI3K/Akt信號通路有關基因、蛋白質表達之間的聯系，抑制VSMC增殖和遷移發生AS，明確疏肝清脂顆粒干預AS中的分子機制，為尋找中醫藥改善AS的有效靶點提供分子生物學依據。

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