Slit2/Robo1信號通路與腫瘤相關性的研究進展

沈益飛, 張云坤

(南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院 骨科, 江蘇 常州, 213003)

1988年 Rothberg等[1]發現果蠅的中樞神經中線膠質細胞可合成Slit蛋白，其缺乏可導致縱行傳導通路和交叉(聯合)神經元軸突在中線發生聚集異常。1998年, Kidd等[2]首次提出Roundabout(Robo)蛋白是Slit的受體，為進一步研究Slit蛋白的功能奠定了基礎。Slit-Robo通路包括Slit分泌蛋白家族(Slit1、2、3)及其特異性受體(Robo1、2、3、4), 其中Slit2/Robo1信號通路最初發現是與中樞神經系統發育有關[3-5], 深入研究[6-8]發現Slit2與Robo1相互作用還可以調節白細胞趨化性、中胚層的遷移以及血管平滑肌細胞的遷移。近年來，越來越多的研究發現, Slit2和Robo1的相互作用可以誘導腫瘤的發生。研究[9-10]表明, Slit2和Robo1的啟動子在幾種不同類型的癌癥中是高甲基化的, Slit2/Robo1參與多種不同的腫瘤細胞活動過程，比如增殖和遷移。本研究對Slit2/Robo1在不同腫瘤中的作用綜述如下。

1 Robo1、Slit2基因及結構特征

人類Robo1基因位于人染色體的3p12.3, 其編碼跨膜蛋白受體。Robo1蛋白包含5個免疫球蛋白結構域, 3個纖連蛋白III結構域, 1個跨膜結構域和1個胞內片段。其細胞內區包含4個特定的保守基序，即CC0、CC1、CC2和CC3。Robo1胞外的IgG結構域被認為是與配體Slit2結合所必需的，胞內區域則和一些重要的信號分子相互作用，參與Slit/Robo下游的信號轉導，從而完成刺激信號由細胞外部至內部骨架的傳遞[11]。

Slit2基因定位于人染色體4p15.2, 編碼人類與果蠅 Slit2 同源的細胞外基質分泌性糖蛋白，是 Slit 基因家族(Slit1～3)的一員，其主要功能是在中樞神經系統發育過程中調節軸突導向和神經細胞的遷移[12]。Slit2蛋白的結構包括1個信號肽、4個獨特的富含亮氨酸重復單位(LLR)D1-D4, 其后連接9個類似表皮生長因子(EGF)重復區(果蠅為7個), 1個群集層黏連蛋白-基底膜蛋白多糖-Slit的保守隔離模體, 1個富含半胱氨酸區。LLR區為與Robo1相互作用及軸突導向作用所必需, EGF重復區和Slit的彌散有關，模體具有調節蛋白-蛋白、基質-蛋白的相互作用的功能[13-14]。

2 Slit2/Robo1與腦膠質瘤

鑒于Slit2/Robo1信號通路在神經發育過程中起著重要作用，研究人員最早將目光投向了其在神經系統腫瘤中的作用。腦膠質瘤組織中的Slit2基因啟動子出現異常甲基化，是導致Slit2的表達下調的主要原因[15]。Li等[16]通過表達譜分析對比正常腦組織及腦膠質瘤組織中Slit2和Robo1的表達量，發現Slit2在腦膠質瘤組織中的表達量明顯低于正常組織，且隨著腫瘤分級的升高而逐漸降低，而Robo1的在腦膠質瘤組織中的表達明顯高于正常組織，預后生存分析Slit2、Robo1均陽性表達的患者生存率明顯優于Slit2陰性表達、Robo1陽性表達患者。在腦膠質瘤中, Slit2的表達與Robo1的表達具有顯著負相關性, Slit2的低表達和Robo1的高表達可能與膠質瘤的侵襲性、惡性進展以及不良預后有著密切的關系，且Slit2的表達缺失和Robo1表達增高可能具有協同作用，二者的差異表達共同促進了膠質瘤的生成，在膠質瘤的發病以及進展中發揮著重要作用。

Slit2/Robo1影響膠質瘤發生發展的機制目前并未明確。Jean J等[17]發現在多種神經膠質瘤細胞系中, Slit2的表達量較正常人星形膠質細胞均有明顯下調，通過體內外實驗證明Slit2通過其受體Robo1抑制膠質瘤細胞中Cdc42的活性，從而通過抑制Cdc42-GTP活性來特異性地抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲。最新研究發現，微小RNA(micro-RNA)可以通過Slit2/Robo1信號通路調控膠質瘤的發生發展。JIAN等[18]發現, microRNA218(mi-218)的過表達可以促進膠質瘤細胞中Slit2的表達，同時降低Robo1的表達，從而抑制腦膠質瘤細胞的侵襲力。

3 Slit2/Robo1與消化系統腫瘤

3.1 Slit2/Robo1與食管癌、胃癌、結直腸癌

Ruo-Chia等[19]通過免疫組織化學、甲基化測序等技術發現，食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中Slit2啟動子高甲基化，導致Slit2蛋白表達降低。體內外實驗發現，敲除Slit2可增強ESCC細胞遷移，而Slit2穩定的過表達則減弱了ESCC細胞遷移。Slit2/Robo1在胃癌的發生和轉移過程中發揮重要作用。Kim等[20]對11個胃癌細胞系、96對胃癌組織和相鄰正常胃組織中的Slit2表達和甲基化情況進行了分析，發現Slit2 在早期胃癌和晚期胃癌中均發現甲基化。Shi等[21]研究發現，在胃癌細胞中干擾Slit2表達會增加AKT磷酸化，從而活化抗凋亡信號，抑制GSK3β活性并誘導β-catenin活化入核，最后激活AKT/β-連環蛋白介導的腫瘤生長信號通路，促進胃癌生長和轉移。Huang等[22]比較結直腸癌組織與癌旁組織發現，CRC組織中Slit2基因的啟動子廣泛超甲基化從而導致Slit2表達減少，進一步研究機制發現，結直腸癌細胞系LoVo、HCT116細胞中的泛素特異性蛋白酶33(USP33)與Robo1相互作用，增強細胞內Slit2表達，進而抑制腫瘤轉移 。Feng Y等[23]通過免疫沉淀(IP)、免疫熒光(IFCRC)等研究方法發現，在結直腸癌細胞中srGAP1是Robo1的相互作用蛋白, srGAP1是CRC中Slit2信號的重要下游分子，通過抑制Cdc42介導Slit2的抗遷移功能。但是，也有學者認為, Slit2/Robo1促進腸道腫瘤發生發展。Qian等[24]研究發現, Slit2/Robo1結合可以通過激活Src磷酸化，進而激活Wnt/β-連環蛋白信號(β-catenin)通路誘導上皮細胞向間質細胞的轉變(EMT)繼而促進腸道腫瘤發生。最新的研究[25]顯示, Slit2還可能是遺傳性結直腸癌(CRC)遺傳易感性的潛在作用基因。

在消化系統腫瘤中，也已發現多種微小RNA(micro-RNA)通過Slit2/Robo1信號通路調控腫瘤細胞的發生發展。miR-1179在ESCC細胞中表達上調，通過抑制Slit2/Robo1通路增強ESCC細胞的侵襲能力[26]; 在胃癌細胞中, miR-218的表達與Slit2的甲基化呈負相關, miR-218通過作用于Robo1干擾Slit2/Robo1通路，從而破壞胃癌血管的行成，抑制腫瘤細胞生長[27]。

3.2 Slit2/Robo1與胰腺癌、肝癌

Katia等[10]從表觀遺傳學的角度研究了Slit2/Robo1在腺癌中的變化，在對167例胰腺導管腺癌組織行大規模的甲基化和表達譜分析后發現, Slit2與Robo1的CpG島和啟動子區域均出現超甲基化現象，從而導致Slit2-Robo1信號通路的表觀遺傳失活。JIANG等[28]建立了胰腺癌細胞系和高淋巴轉移潛能的小鼠模型，并觀察到胰腺癌細胞淋巴結轉移型小鼠中Robo1較未出現淋巴結轉移的小鼠表達下調。值得注意的是, Secq等[29]研究了腫瘤內微環境(基質)對PDAC進展的影響，發現癌相關成纖維細胞(CAF)分泌Slit2通過調節N-鈣黏蛋白/β-catenin信號傳導，促進背根神經節神經元以及施旺(Schwann) 細胞遷移與增殖，從而增加神經突的生長，抑制Slit2/Robo1信號傳導則可破壞這種基質、神經連接，減少患者術后復發率和腫瘤后期疼痛感。Jin[30]等首先報道了肝癌細胞中(HCC)中存在Slit2的表觀遺傳學沉默，他們通過對54例原發性肝癌組織進行甲基化分析發現，由于Slit2的CpG島高甲基化，使其表達較正常肝細胞下調。Mano等[31]通過體內外實驗發現，抑制Slit2/Robo1表達可以促進肝癌細胞增殖和遷移，而過度表達Robo1與Slit2則可以顯著抑制癌細胞增殖和遷移。Slit2/Robo1為肝癌的治療提供一個新的可能治療靶點。

4 Slit2/Robo1與婦科腫瘤

4.1 Slit2/Robo1與卵巢癌

RDONG等[32]研究發現，卵巢癌組織和卵巢癌患者血清樣品中Slit2基因啟動子出現異常甲基化狀態，其中包括早期卵巢癌患者的血清樣品。Hai等[33]也發現了上述現象，在將Slit2去甲基化恢復表達后，可以明顯抑制卵巢癌細胞生長、遷移、集落形成能力并誘導腫瘤細胞凋亡。 這些結果表明Slit2是卵巢癌的腫瘤抑制因子，將來可能是卵巢癌治療的新靶點。

4.2 Slit2/Robo1與子宮內膜癌、子宮頸癌

子宮內膜癌(EC)是常見的女性惡性疾病，約占女性腫瘤的7%, 是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤，占生殖道惡性腫瘤的20%～30%[34]。目前的研究主要認為, Slit2/Robo1信號通路通過調控內膜癌組織中的微血管密度而影響子宮內膜癌的預后及復發。Shulan等[35]對比了45例子宮內膜癌復發患者與110例未復發患者的Slit2與Robo1的表達情況，發現Slit2和Robo1在復發組內膜癌中表達明顯高于未復發組，且Slit2和Robo1 表達均與微血管密度(MVD)呈正相關。有趣的是，目前有學者[36]發現，一定濃度雌激素可以刺激子宮內膜癌細胞中的Slit2 mRNA的表達，而孕激素則會拮抗上述作用。Ratnesh KS等[37]通過微衛星分析發現，在宮頸癌組織樣本中Slit2啟動子超甲基化及Slit2缺失現象，經多因素分析顯示Slit2缺失與其啟動子甲基化存在顯著相關性，可能在宮頸癌發展中起重要作用。Sraboni M等[38]通過對宮頸癌組織樣本和宮頸癌細胞系進行表達譜分析發現，原發性宮頸癌中Slit2和Robo1的RNA和蛋白質表達均降低，認為Slit2/Robo1的表達水平與腫瘤的分期和預后有關, Slit2/Robo1表達越低則預示著腫瘤分期越高、預后越差。

5 Slit2/Robo1與其他腫瘤

5.1 Slit2/Robo1與乳腺癌

Slit2/Robo1在乳腺癌發生、發展及腦轉移過程中發揮重要作用。Dallol等[39]發現乳腺癌患者組織中的Slit2基因啟動子出現異常甲基化，從而下調了Slit2的表達。Feng等[40]通過評估118例浸潤性導管癌(IDC), 44例導管原位癌(DCIS)和34例良性乳腺病變的Slit2和Robo1的免疫組織化學染色、mRNA表達水平發現, Slit2和Robo1低表達的浸潤性導管癌患者預后較差，且較大概率出現腦特異性轉移。Chang等[41]對乳腺癌細胞微環境研究發現，乳腺癌細胞的致癌潛力是由其Robo1受體及其間質成纖維細胞分泌的配體Slit2之間的相互作用決定的。活性Slit2/Robo1信號的存在能阻止β-catenin轉移到細胞核中，繼而通過磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途徑下調c-myc和細胞周期蛋白D1的表達。結合臨床，乳腺癌細胞中的Robo1表達與乳腺癌患者生存期呈正相關，基質成纖維細胞中Slit2的低表達與淋巴結轉移有關。根據目前研究提示Slit2/Robo1可能在抑制乳腺癌發生發展及腦轉移過程中發揮重要作用。可能成為判斷乳腺癌預后和腦轉移的分子標志物，為乳腺癌的治療提供新靶點。

5.2 Slit2/Robo1與肺癌

Slit2/Robo1在肺癌中的作用較為復雜。Yong-Jae等[42]對人肺鱗狀細胞癌(SCC)組織與正常肺組織進行焦磷酸測序法分析發現，肺癌組織中Slit2啟動子區域的出現高甲基化現象。Suzuki等[43]在非小細胞肺癌組織中也檢測到類似現象。Li等[44]對非小細胞肺癌癌旁組織、肺癌組織、腦轉移組織進行Robo1表達進行檢測，發現Robo1的陽性表達率依次增高，且 Robo1在肺癌腦轉移中的表達與肺癌腦轉移患者的預后呈負相關。Wen等[45]進一步發現了泛素特異性蛋白酶33(USP33)可以調節肺癌細胞的Slit-Robo信號傳導，在正常肺細胞中, Slit2結合Robo1并激活下游分子，調節肌動蛋白細胞骨架并抑制細胞遷移。 去泛素化酶USP33可減少Robo1的泛素化和降解，從而穩定Robo1蛋白。 然而，在肺癌細胞中，表達下調的USP33導致Robo1的泛素化和降解增加，從而干擾了Slit2/Robo1信號通路，進而促進肺癌細胞遷移。

6 小 結

Slit2/Robo1在不同腫瘤中機制不同，作用也不盡相同。Slit2/Robo1除了通過抑制或促進Wnt/β-catenin等經典的原癌通路來促進或抑制腫瘤的發生發展，也可以通過影響腫瘤血管密度、腫瘤微環境來影響腫瘤的增殖與轉移。值得注意的是，在結直腸癌中，不同的學者發現了Slit2/Robo1兩種相反的作用，這可能與Robo1的突變有關。Feng等[46]在體外實驗中發現，在白血病細胞中過表達Robo1可以產生抗增殖和促凋亡作用，然而，這種作用在Robo1突變體中喪失。Robo1在結直腸癌或其他腫瘤中是否存在突變并引起相反的兩種作用值得進一步研究。近年來，隨著對microRNA的認識及研究深入，目前已發現多種miRNA通過作用于Slit2或Robo1從而影響腫瘤的進展。其中miR-218在膠質瘤、胃癌等多種腫瘤中均可以作用于Slit2/Robo1起到抑癌作用，這也為腫瘤的靶向治療提供新的思路。因此, Slit2/Robo1信號通路有可能成為多種腫瘤預防和治療的潛在靶標。