ε-聚賴氨酸生產菌的硫酸二乙酯誘變及其 發酵培養基優化

李聰，扶教龍*，施磊，吳晨奇，扶明明，胡翠英

(1.蘇州科技大學 化學生物與材料工程學院，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州農業職業技術學院 食品科技學院，江蘇 蘇州 215008；3.贛州農業學校，江西 贛州 341100)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)最早由日本學者Shima S和Sakai H發現并命名，他們在試圖尋找一種分泌生物堿的微生物時，意外地從白色鏈霉菌(Streptomycesalbulus)的發酵液中發現了這種生物堿的類似物[1]。

ε-聚賴氨酸是一種賴氨酸的同聚物，與一般氨基酸聚合物不同，它是由α-氨基和ε-羧基的作用將L-賴氨酸殘基連接起來的聚合物，其聚合度一般為25～35[2]。其具有非常廣泛的抑菌譜和優異的抑菌效果，對革蘭氏陽性、陰性細菌、霉菌和真菌等微生物的生長均有出色的抑制效果[3]。同時，又因為其具有熱穩定性好、易溶于水、酸堿耐受性強及難以被人體吸收(安全性好)等特點，所以ε-PL被廣泛地應用于食品領域，作為一種綠色健康的食品防腐劑。繼日、美、韓等國家后，我國也于2014年將其批準用作食品添加劑[4]，ε-PL應用的發展方興未艾。

工業的生產得益于產量的提高，野生的ε-PL生產菌產量低下，因此對其進行育種改造至關重要。物理、化學誘變是最傳統同時也是最為行之有效的育種途徑；余明潔、楊玉紅等[5，6]對出發菌進行了紫外誘變，ε-PL產量都有顯著提高；賈士儒、陳瑋瑋等[7，8]用化學誘變的方法處理了白色鏈霉菌的孢子并取得了不錯的效果。除了培育出更高產的菌種，對其培養基的優化能改善生產菌的生長情況與代謝途徑，從而進一步提高ε-PL的產量。Shih和Shen[9]對培養基中的主要營養組分(酵母粉、葡萄糖和硫酸銨)進行了優化，最終產量與原始配方相比提高了98.4%。其中江南大學利用誘變菌株Streptomycessp. M-Z18經補料發酵，并在發酵液中加入滑石粉結合pH沖擊技術，ε-PL產量達到了62.36 g/L，是現階段報道的最高水平[10]。

本實驗對出發菌白色鏈霉菌FQ-23進行Gly，SG，L-Lys三重抗性篩選，通過DES誘變后，篩選得到高產突變菌。然后篩選出更為適合的有機氮源并利用響應面法對原始培養基中的成分進行了優化，獲得了更高的ε-PL產量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

白色鏈霉菌(Streptomycesalbulus)FQ-23。

1.1.2 儀器設備

KU-T3紫外-可見光分光光度計 上海精密儀表有限公司；SW-CJ-1FD/2FD型超凈工作臺 蘇州尚田潔凈技術有限公司；DKY-Ⅱ型恒溫調速回旋式搖床 上海社科自動化有限公司；HT-250B電熱恒溫培養箱 上海赫田科學儀器有限公司；SPX-250BSH-Ⅱ型生化培養箱 新苗醫療器械制造有限公司。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 斜面/平板培養基

葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨2 g/L，pH 7.0～7.5，1×105Pa滅菌15 min。

1.1.3.2 三重抗性平板

在斜面/平板培養基的基礎上添加Gly 5.95 g/L，SG 4.80 g/L，L-Lys 1.35 g/L，pH 7.0～7.5，1×105Pa滅菌15 min。

1.1.3.3 種子/搖瓶發酵培養基

葡萄糖50 g/L，酵母粉5 g/L，(NH4)2SO410 g/L，磷酸二氫鉀1.36 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.8 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，硫酸鋅0.04 g/L，pH 6.8，1×105Pa滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變方法

1.2.1.1 單孢子懸液的制備

將滅菌后的生理鹽水注入斜面，用無菌竹簽將孢子輕輕刮下，充分攪拌制成孢子懸液，最后經8層無菌紗布過濾，制成單孢子懸液。

1.2.1.2 誘變時間的選擇

取1 mL單孢子懸液稀釋10倍，用pH為7.0的磷酸緩沖液稀釋7次(每次稀釋10倍)，將最低濃度的孢子懸液分別吸取5 mL至7個小搖瓶中，后將5 mL濃度為2%的DES分別加入小搖瓶中，即DES的含量僅為1%，將7個小三角瓶于恒溫振蕩器中振蕩0～60 min，每隔10 min取出1瓶，在取出的搖瓶內加入1 mL硫代硫酸鈉作為誘變終止劑，充分振蕩后保證混勻，孢子濃度稀釋至108左右后將其涂布于平板之上，設3組平行，30 ℃恒溫培養一段時間，分析誘變時間對死亡率的影響。

1.2.1.3 初篩

將經過誘變后的菌株置于平板上，并在30 ℃恒溫的環境下培養，挑取長勢良好的單菌落，擴培至斜面培養基用于下面的復篩工作。

1.2.1.4 復篩

從初篩菌株的斜面中各挑取2環孢子分別接入發酵搖瓶中，經過3天發酵，測出ε-PL產量。

1.2.1.5 傳代穩定性實驗

將復篩中得到的高產菌株于斜面進行連續傳代培養，并對各代菌株進行搖瓶發酵，測定ε-PL產量，考察高產菌株是否具備穩定的高產量。

1.2.2 測量方式

1.2.2.1 測定的含量

出于實驗目的的考慮，本文選擇文獻[11]法測定ε-PL的含量。標準曲線參考吳晨奇等[12]的方法。

1.2.2.2 菌體干重(DWC)的測定

取9 mL發酵液至離心管中，4000 r/min離心10 min，保留沉淀；將該沉淀用去離子水洗滌2次后置于烘箱烘干至恒重。

1.2.3 培養基優化

1.2.3.1 單因素實驗

通過對酵母粉、玉米漿、牛肉膏、魚粉、生物素和蛋白胨這6種有機氮源的篩選，挑選出2種最佳的有機氮源，并對培養基中葡萄糖、硫酸銨和2種有機氮源進行單因素實驗，找出這4種關鍵成分的最適濃度。各實驗因子濃度梯度設計見表1。

1.2.3.2 CCD中心組合實驗設計

中心組合實驗(central composite design，CCD)是以2水平全因子和分部實驗為基礎，發展出來的1種實驗設計方法。它通過對2水平的實驗添加1個設計點，評估出輸出變量和各因素間的關系，并將這種非線性關系擬合生成響應面。

在單因素實驗結果的基礎上，以上述培養基最優濃度為基礎，利用對不同因素進行分析，并按表2進行實驗設計。

表2 CCD實驗設計Table 2 Design of central composite design g/L

2 結果與分析

2.1 DES誘變時間的確定

DES是一種常見的烷化劑，它通過參與和若干堿基的反應過程，致使DNA的復制過程紊亂，其堿基對間的配對出現錯誤，最終導致菌株死亡或變異。因此，其能夠強烈地促成微生物細胞的變異。在低濃度DES溶液(1%)的作用下，做出致死率與誘變時間之間的關系圖，通過致死率曲線來找出致死率在80%～85%左右的最佳誘變時間，其致死率曲線見圖1。

圖1 白色鏈霉菌DES誘變致死率曲線Fig.1 The DES fatality rate curve of Streptomyces albulus

由圖1可知，在誘變30 min時，該菌株的致死率約為82%，因此設置30 min為實驗的最優時間。

2.2 突變菌株抗性篩選

孢子懸液經過30 min的誘變后，被涂布于抗性平板之上。設置3組抗性平板，第1組和第2組分別為加入了較低和較高濃度的Gly，L-Lys和SG的平板；第3組不添加抗性。

挑取平板中長勢最好的單菌落，轉接入斜面保藏。本實驗共挑取了40株長勢良好的單菌落，其中1～10號菌挑選自第1組平板，11～20號菌挑選自第2組平板，21～40號菌挑選自第3組平板。將這40株菌分別進行72 h左右的搖瓶發酵培養，測定各自的ε-PL產量。誘變實驗結果見圖2，出發菌產量見圖中虛線所示，為0.896 g/L。

圖2 DES誘變篩選結果Fig.2 Results of DES mutagenesis screening

由圖2可知，在總共40株菌中，產量高于出發菌株的有10株，其正突變率為25%，其中1～10號菌株(低濃度3種抗性組別)中有8株產量高于出發菌株，正突變率高達80%。其中，3，4，6，7，16，25號這6株菌的ε-PL產量較出發菌有明顯的提高，3號菌株的產量為1.042 g/L，4號菌株的產量為1.167 g/L，6號菌株的產量為1.219 g/L，7號菌株的產量為1.104 g/L，16號菌株的產量為1.062 g/L，25號菌株的產量為1.090 g/L。

2.3 突變菌株傳代穩定性考察

對上述產量較高的6株菌進行遺傳穩定性實驗，在培養了6代之后發現3號菌株可穩定遺傳，并將其命名為白色鏈霉菌FQF-3。

圖3 菌株FQF-3的傳代穩定性實驗結果Fig.3 The experimental results of genetic stability of strain FQF-3

由圖3可知，白色鏈霉菌FQF-3的產量較為穩定，2～6代菌的產量均高于出發菌，可用于今后進一步的研究。

2.4 培養基優化

2.4.1 不同有機氮源對ε-聚賴氨酸的影響

有機氮源對微生物生長至關重要，只有合理地在培養基中加入有機氮源，菌體的生長和產物的代謝才能正常進行[13]。本部分實驗旨在探究不同有機氮源對菌體生長和ε-PL合成的影響，見圖4。

圖4 不同有機氮源對ε-PL產量的影響Fig.4 Effect of different organic nitrogen sources on ε-PL production

當有機氮源為魚粉時，ε-PL產量最高，為1.11±0.03 g/L，顯著高于酵母粉等其余有機氮源。此外，當把玉米漿作為培養基中唯一的有機氮源時，白色鏈霉菌的菌體濃度顯著高于其他實驗組。鑒于發酵生產時，ε-PL產量與菌體量相偶聯，越高的菌體量通常代表著越高的產量。因此，我們將魚粉和玉米漿復配進行后續研究，以期獲得更高的ε-PL產量。

2.4.2 通過實驗確定碳氮源濃度

無可否認，氮源是微生物繁殖過程中不可或缺的成分，在上述實驗中選擇了魚粉和玉米漿作為混合有機氮源后，本部分實驗將混合有機氮源、葡萄糖和硫酸銨進行單因素實驗，以探究不同濃度的相應組分對產量的影響，單因素實驗結果見表3。

表3 單因素實驗結果Table 3 Results of single-factor experiment

由表3可知，葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、魚粉的最適濃度分別為50,10,8,12 g/L，ε-PL的產量分別為0.97±0.03，0.95±0.05，0.85±0.03，0.98±0.04 g/L。

2.4.3 響應面法優化發酵培養基

2.4.3.1 建立模型，檢驗實驗結果

探討不同因素對菌株培養效果的影響后，利用Design-Expert，設計成四因素五水平的實驗，以求對上述4大成分進一步優化，實驗方案及其結果見表4。

表4 CCD實驗結果Table 4 The experimental results of central composite design g/L

將表4中各參數的數據進行對比分析，通過軟件進行擬合從而建立以下方程，表達不同因素對ε-PL產量(Y)的影響，A，B，C，D分別代表葡萄糖、硫酸銨、玉米漿和魚粉：Y=1.370-0.066A-0.004B-0.010C+0.027D-0.006AB+0.005AC-0.004AD+0.010BC+0.009BD-0.007CD-0.083A2-0.087B2-0.081C2-0.110D2。

對結果進行顯著性檢驗和方差分析，結果見表5。

表5 響應面實驗回歸系數檢驗表Table 5 ANOVE analysis for regression equation

續 表

由表5可知，該模型總體的P值(P-Value)<0.0001，表明總體來說，該模型偶然誤差很小，有較好的擬合度且高度顯著；其中，失擬項(Lack of Fit)僅為0.1131，可見該模型的失擬項較小，失擬并不顯著，模型較為可靠；經過計算可知，方程系數接近1，擬合度較好，由此可見，我國能夠直接通過這一方程直觀地表現出ε-PL產量與4個自變量之間的關系，從而預測出較為準確的結果。

2.4.3.2 優化響應面

為探討不同因素之間的影響以及與菌株產量之間的關系，本文設計了單因素實驗，并且得到了不同的響應面圖，見圖5～圖10。

圖5 葡萄糖和(NH4)2SO4的響應面結果Fig.5 Response surface plot for glucose and (NH4)2SO4

圖6 玉米漿和葡萄糖的響應面結果Fig.6 Response surface plot for corn pulp and glucose

圖7 葡萄糖和魚粉的響應面結果Fig.7 Response surface plot for glucose and fish meal

圖8 (NH4)2SO4和玉米漿的響應面結果

圖9 (NH4)2SO4和魚粉的響應面結果Fig.9 Response surface plot for (NH4)2SO4 and fish meal

圖10 玉米漿和魚粉的響應面結果Fig.10 Response surface plot for corn pulp and fish meal

由圖5～圖10可知，各因素過高或過低均會影響ε-PL的發酵水平，當保持其中一成分不變時，ε-PL的產量會先隨著另一成分的增加而增加，但當該成分超過一定值時，ε-PL的產量則會相應降低，反之亦然。以圖5為例子，如果葡萄糖的濃度始終保持不變，那么當硫酸銨的濃度不斷提高時，可發現菌株的產量也有所提高。換言之，兩者呈正相關關系，直到硫酸銨濃度超過10 g/L，ε-PL的產量開始隨硫酸銨濃度的提高而下降。當保持硫酸銨濃度不變時，ε-PL產量與葡萄糖濃度的關系大致相同，也是先提高后降低。

在上述實驗結果的基礎之上，通過軟件對各參數的分析，得到了預估的最佳成分，見表6。

表6 培養基預測結果表Table 6 The prediction results of medium composition g/L

表6中所示成分加上M3G培養基中剩余成分即為最佳培養基，在該培養基下，預估所得ε-PL產量達到了1.373 g/L，比出發菌株提高了53.2%。

2.4.3.3 優化培養基的驗證

按上述的配方往培養基中加入各物料，隨后等待菌株發酵，在此過程中將搖瓶放入搖床并設置搖床條件為：30 ℃，200 r/min，經過72 h的培養，測出發酵液中ε-PL的含量。進行3次同樣的實驗，數據分別為1.368,1.374,1.371 g/L。

該實驗結果與預測值基本保持一致。換言之，本次實驗數據具有研究意義，所建立的模型準確性較高。

3 結論與展望

本實驗以在StreptomycesalbulusFQ-23的基礎上，利用DES誘變的方式，得到了1株穩定遺傳的高產菌株FQF-3，經6代連續培養產量穩定在0.976 g/L，與出發菌株相比提高了8.93%；經過篩選，將魚粉與玉米漿作為發酵產ε-PL的混合有機氮源；通過單因素結合響應面的方法對其培養基進行優化，可知培養基最合適的組合是(g/L):葡萄糖49.70，(NH4)2SO49.95，玉米漿7.79，魚粉12.52，磷酸二氫鉀1.36，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀0.8，硫酸亞鐵0.03，硫酸鋅0.04，此時，ε-PL的預測產量為1.373 g/L，是出發菌株產量的1.53倍；經過3次重復實驗的驗證，得到ε-PL產量的平均值為1.371 g/L，與預測值非常接近，表明此模型具有可行性。

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