間充質干細胞的旁分泌作用在組織損傷修復中的研究進展

李小麗 王炎 朱鐘慧 田琳

1首都醫科大學附屬北京友誼醫院、北京熱帶醫學研究所寄生蟲病研究室、熱帶病防治研究北京市重點實驗室（北京100050）；2首都醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學系、首都醫科大學環境毒理學北京市重點實驗室（北京100069）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種非造血干細胞的成體干細胞，具有自我更新、多向分化的能力，同時還展現出抑制惡性細胞增殖、免疫調節及抗炎的特性［1］。隨著研究的深入，學者們逐漸認識到MSCs的旁分泌效應在組織損傷中起到積極作用。MSCs通過分泌一些可溶性生物活性因子，抑制細胞凋亡和纖維化、促進血管再生、刺激組織內祖細胞有絲分裂和（或）分化以及調節免疫反應促進損傷組織的修復再生［2］。目前MSCs已在骨組織、心肌、腎臟、肺臟、腦組織及肝臟的損傷（如毒性藥物、缺血再灌注損傷）中廣泛應用［3-4］。MSCs還具有種子細胞的特性，如容易獲取、能夠快速、大量擴增、無或具有低免疫原性及具有較高純度，所以在組織工程與再生醫學研究中發揮著重要作用。因此，本文就近年來MSCs的旁分泌功能在組織損傷修復中的作用及其機制研究進展作一綜述。

1 免疫調節作用

MSCs對固有免疫和適應性免疫均有很強的調節作用。

1.1 固有免疫

1.1.1 巨噬細胞巨噬細胞按照功能的不同可分為M1型和M2型，M1型巨噬細胞以分泌促炎因子為主，發揮促炎功能，導致機體組織的炎癥損傷［5］。其分泌的炎性因子一氧化氮、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF?α）、白細胞介素-6（interleukin?6，IL?6）等，均具有很強的抗原呈遞作用。但是在MSCs的作用下，這些反應均可被抑制。M2型巨噬細胞可抑制炎癥反應，發揮修復組織的功能，以上功能可被MSCs促進。所以MSCs通過對M1/M2型巨噬細胞的調節，抑制炎癥反應，促進組織的修復。

靳麗媛等［6］報道MSCs的上清液可以促進巨噬細胞向M2型分化，同時使炎癥因子的分泌減少，抗炎因子的分泌增多。在哮喘研究中，人骨髓來源的MSCs可以促進肺泡巨噬細胞向M2型分化，但并不會增加巨噬細胞的總量，從而有效抑制氣道高反應性及嗜酸性粒細胞的大量沉積［7］。在橫紋肌溶解引起的急性腎損傷中，MSCs促使M2型的巨噬細胞在損傷腎組織中聚集，從而起到抗炎作用，保護腎功能的繼續損害及腎小管的損傷。將MSCs與巨噬細胞RAW264.7細胞共培養，發現促炎因子TNF?α、IL?6含量降低，抗炎因子IL?10的含量增加，同時M2型巨噬細胞標志物CD206表達增加，說明MSCs促使巨噬細胞向M2型分化［8］。研究還發現MSCs對巨噬細胞的調節作用是通過旁分泌因子前列腺素E2（prostaglandin?E2，PGE2）來實現的。1，25-二羥基維生素D3可以促使MSCs分泌更多的PGE2和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），減少炎性因子的產生，從而調節巨噬細胞引起的炎癥反應［9］。

1.1.2 中性粒細胞在免疫復合物引起的血管炎研究中，MSCs可以抑制中性粒細胞的呼吸爆發，降低細胞死亡及過氧化物酶的釋放，從而減少組織損傷。給予不同數量的MSCs，中性粒細胞的氧化還原反應被抑制，MSCs的數量越多，其抑制作用越顯著。MSCs還可抑制中性粒細胞死亡的數量，其釋放的各種酶如髓過氧化物酶、基質金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP?9）及中性粒細胞彈性蛋白酶的釋放也被抑制。其抑制機制為MSCs分泌的細胞間黏附分子-1下調了中性粒細胞的吞噬作用及胞外過氧化物歧化酶3的釋放，減輕了氧化應激的水平，從而抑制中性粒細胞的死亡及蛋白酶的釋放［10］。急性肺損傷時，大量中性粒細胞迅速進入肺實質，釋放氧自由基、蛋白溶解酶及炎癥介質，加重炎癥反應［11］。MSCs可抑制以上物質的釋放，減輕肺組織的炎癥反應及氧化性損傷，提高動物的存活率［12］。

1.1.3 樹突狀細胞（dendritic cells，DC）MSCs可以通過旁分泌腫瘤壞死因子α刺激基因-6（tumor necrosis factor?inducible gene 6，TSG?6）抑制DC的成熟及功能［13］。成熟的DC 高表達抗原 CD80、CD86、MHC?II及 CD11c，未成熟的DC均低表達這些抗原。當成熟的DC加入MSCs后，其表面的上述抗原表達降低，說明MSCs可以抑制DC的成熟。將MSCs的TSG?6基因沉默之后，再與DC共培養，發現DC的成熟度未被抑制，說明MSCs確實通過TSG?6抑制DC的成熟。另一方面MSCs還可以抑制DC的功能。成熟的DC分泌IL?2，DC越成熟，分泌的IL?12越多。IL?12可激活T淋巴細胞，促進其增殖，同時提高干擾素（interferon?γ，IFN?γ）的水平。MSCs可抑制DC分泌IL?12，降低T細胞的增值及IFN?γ的水平。但是加入了TSG?6基因沉默的MSCs后，DC被抑制的功能均可得到恢復，由此證明MSCs通過旁分泌TSG?6抑制DC的功能。所以，MSCs可以通過旁分泌細胞因子抑制DC的成熟及功能，調節免疫反應。

1.1.4自然殺傷（natural killer，NK）細胞MSCs可以抑制NK細胞的功能改變其細胞表型，同時也可以抑制NK細胞的增殖、細胞毒性以及NK細胞所分泌細胞因子的釋放，如IFN?γ、TNF?α、IL?10、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子及其他調節炎癥反應的趨化因子。在敗血癥模型小鼠體內，MSCs能刺激肺組織中IL?10的表達升高，抑制IL?6、IFN?γ及TNF?α等促炎因子的表達。其具體機制為MSCs通過激活JAK/STAT信號通路，上調細胞因子信號轉導抑制因子3的目的基因，抑制NK細胞的功能及增殖［14］，從而減輕敗血癥的炎癥反應。

1.2 適應性免疫

1.2.1T淋巴細胞眾多肺組織損傷的研究報道中，MSCs有調節T淋巴細胞的作用，其中包括過敏性氣道炎癥及急性肺損傷。而MSCs調節T細胞的作用表現為不同的作用機制，如MSCs具有抑制T淋巴細胞增殖的作用［15］，其旁分泌的轉化生長因子-β及肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是MSCs抑制T淋巴細胞增殖的主要調節因子。也有報道稱MSCs旁分泌的PGE2參與了對T淋巴細胞的抑制作用。MSCs還可以抑制T淋巴細胞分泌相應的細胞因子。程序性死亡受體1（programmed death?1，PD?1）是一種重要的免疫抑制分子，廣泛分布于各種組織中。PD?1與其配體PD?L1結合后可以抑制T淋巴細胞的增殖及其細胞因子的產生。自身免疫性肝炎的研究中，MSCs可以降低血清中轉氨酶的水平，減輕肝臟組織的病理損害。其作用機制與抑制Th17所分泌IL?17的產生，上調PD?1的表達有關。小鼠的自身免疫性肝炎模型經尾靜脈注射MSCs，無論是Western blot還是real?time PCR檢測，PD?1的表達明顯升高，促炎因子IL?17表達下降，說明MSCs通過上調了PD?1，抑制T細胞分泌IL?17，改善肝臟的免疫反應［16］。所以在T淋巴細胞介導的細胞免疫中，MSCs可通過旁分泌途徑調節T淋巴細胞的功能。

1.2.2B淋巴細胞MSCs能抑制B淋巴細胞的增殖、分化及抗體的分泌。MSCs使B淋巴細胞滯留于G0/G1期，抑制B淋巴細胞的增殖。MSCs還可以通過PD?1/PD?L1的調節，抑制B淋巴細胞的激活。但也有文獻報道MSCs可促進純化的小鼠B淋巴細胞的增殖與分化。雖然以上結果完全相反，但ROSADO等［17］的研究給出了合理解釋。免疫反應中，MSCs對B淋巴細胞進行免疫調節的同時會伴有T淋巴細胞的參與。MSCs需要CD3+T淋巴細胞的參與，來發揮抑制B淋巴細胞增殖的作用。無論MSCs、T淋巴細胞及B淋巴細胞之間直接接觸，還是他們所分泌的可溶性細胞因子，都依賴PD?1/PD?L1的調節作用。通過PD?1/PD?L1的調節，MSCs抑制濾泡及邊緣區B淋巴細胞的激活。T淋巴細胞釋放的細胞因子IFN?γ可以激發MSCs與B淋巴細胞之間PD?1/PD?L1的作用。若MSCs抑制T淋巴細胞釋放IFN?γ，則PD?1/PD?L1信號通路被阻止，MSCs則無法發揮抑制B淋巴細胞的作用，B淋巴細胞的增殖及分化功能可以得到恢復。所以MSCs在調節免疫反應的過程中，各種細胞及細胞因子相互關聯、相互作用，會得到不同的實驗結果。

研究證實MSCs還可以抑制B淋巴細胞分化為漿細胞。通過細胞的直接接觸，MSCs可以抑制B淋巴細胞向漿細胞分化［18］。MSCs產生的白介素1受體拮抗劑抑制了B淋巴細胞的成熟分化［19］。

2 抗氧化應激

MSCs有減輕氧化應激的作用。首先MSCs可以增加清除自由基的酶類表達，如NADPH依賴的醌氧化還原酶（NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1）、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶及血紅素氧化酶-1（heme oxygen?ase?1，HO?1）。脂多糖引起的急性肺損傷中，給予 MSCs后，抗氧化酶HO?1的表達量明顯增高，過氧化指標丙二醛的表達量明顯降低，說明MSCs通過提高HO?1的表達，減輕脂多糖引起的急性肺損傷［20］。在腎臟的缺血再灌注損傷中，過表達HO?1的MSCs可促進腎臟組織損傷修復因子基質細胞衍生因子-1、VEGF及HGF的分泌，腎功能及病理損傷明顯好轉［21］。

Nrf2是一種調節氧化應激反應的重要轉錄因子，氧化應激促使Nrf2被激活并進入細胞核，與核內的Mar蛋白結合形成異二聚體后識別并結合抗氧化反應元件，啟動ARE調控的多種抗氧化酶及II相解毒酶基因表達或活化，如SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽S轉移酶、HO?1等，來增加細胞對氧化應激的抗性［22］。在博來霉素誘導的肺纖維化中，博來霉素減少了抗氧化物質基因NQO1、HO?1及Nrf2的表達。給予MSCs移植后，可通過增加上述抗氧化物質的表達，激活Nrf2通路，抑制氧化應激反應，阻止膠原蛋白的沉積，減輕肺組織的纖維化程度［23］。

3 血管新生及血管發生

MSCs可修復機體組織的缺血梗死，如心肌梗死、腦缺血缺氧及腎缺血性損傷。MSCs可以促進內皮細胞的增殖、發芽及遷移，形成血管樣的結構，它還可以旁分泌血管再生所需的各種細胞因子促血管再生。MSCs能夠分泌足夠的VEGF促進血管內皮細胞增殖［24］。雖然VEGF對血管形成的調控占主導地位，但血管形成過程復雜，還有其他因子參與。在心肌缺血的大鼠模型體內，注射MSCs條件培養基（MSCs conditioned medium，MSCs?CM）可促進心肌梗死邊緣毛細血管的形成，縮小心肌梗死的面積，說明MSCs通過旁分泌的方式達到改善心肌功能的作用。基因芯片技術檢測提示MSCs分泌的因子多數為促進血管生成的細胞因子，如VEGF、堿性纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、促血小板生成素及血小板源性生長因子-BB［25］。這些促進血管生成的細胞因子參與了組織修復及血管的形成。

除了這些細胞因子，基質金屬蛋白（MMPs）在血管生成中也占有很重要的地位。在體外實驗中，MSCs?CM雖然不含有VEGF，但是依然發現內皮細胞的遷移和毛細血管的形成，說明即使無VEGF存在，MSCs分泌的其他細胞因子也能促進血管的生成，但前提是有高濃度的金屬蛋白酶及MMP?2的存在［26］。血管損傷后發生的血管重構包括血管平滑肌細胞增殖、遷移、凋亡和細胞外基質的改變，這些變化部分由MMPs介導。在三維空間培養MSCs時，MSCs對內皮毛細血管樣結構的形成發揮關鍵作用，但加入MMPs抑制劑后，內皮血管發芽則停止，說明MSCs在調節血管生成的過程中，需要有MMPs的參與［27］。

MSCs通過多種途徑改善組織供血狀況，目前認為其旁分泌促血管生成因子是其重要機制。

4 外泌體

外泌體也稱細胞外囊泡，是直徑大約40～100 nm的囊泡，由多種細胞內膜以出芽方式形成的多泡體，釋放到細胞間隙，參與細胞間的信息交流，并參與多種生理病理過程［28］。現已證實除了MSCs，還可以分泌外泌體的細胞包括：肥大細胞、淋巴細胞、DC及腫瘤細胞［29-31］等。外泌體在細胞間傳遞的物質包括：蛋白、脂質、mRNA及多種生物活性成分。

MSCs的外泌體作為細胞間信號傳遞的介質，其修復潛能己經在各種疾病模型中得到證實。在肺動脈高壓大鼠模型中，MSCs源性外泌體能有效降低平均肺動脈壓及右心室壓，改善肺血管與右心室重構，抑制肺部炎性細胞浸潤，減輕組織纖維化［32］。在心肌缺血/再灌注模型中，外泌體可以減少心肌梗死的面積，改善再灌注的損傷［33］。外泌體對腎損傷也有保護作用。在2型糖尿病腎病及胰島素缺陷型糖尿病腎病的小鼠模型中，含有外泌體的MSCs?CM可使血清中的肌酐及尿素氮水平明顯降低，腎小管間質的炎性因子TNF?α的表達降低，腎小管上皮細胞的上皮-間質轉化被抑制，腎纖維化的程度得到改善。外泌體還起到腎小管上皮細胞間緊密連接結構的保護作用及抗凋亡作用［34］。在股動脈切除的小鼠體內，給予外泌體可以促進血管再生相關性因子的表達，促進血管內皮細胞的增殖、遷移及血管的形成，改善下肢缺血的癥狀［35］。外泌體的研究也涉及到了肝臟疾病，在肝臟缺血再灌注損傷的模型中，外泌體使血清轉氨酶水平明顯降低，減輕了肝細胞損傷程度，對肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用［36］。

雖然外泌體的研究在各種疾病中均表現出較好的效果，但是它發揮作用的機制及具體成分仍需進一步去探討。

5 結語

越來越多的研究者從細胞旁分泌途徑來揭示MSCs進行組織修復損傷的機制。MSCs能夠分泌各種旁分泌因子及外泌體，與損傷組織周圍的各種實質細胞共同作用，發揮免疫調節、抗氧化應激、血管再生等旁分泌作用。MSCs的這一特性對器官損傷修復具有重大臨床意義。