人前列腺癌組織Krüppel-like factor 4（KLF4）和E-cadherin蛋白的表達及其與危險因素等級間的關系*

張 能 蘇 鵬 崔 偉 黃 翔 李曉光 羅 旭

遵義醫學院附屬醫院泌尿外科（貴州遵義 563003）

局限性前列腺癌行根治術后5年存活率可高達99%，但發生遠處轉移的患者5年生存率僅28%[1]。PSA、Gleason分級和臨床分期是前列腺癌危險因素分級的三個關鍵因素，隨危險因素等級升高患者預后越差。因此，對危險因素相關的蛋白標記物深入研究有重要的臨床價值。轉錄因子KLF4屬于組織依賴型基因，既可以作為腫瘤抑制基因也可以扮演癌基因[2,3]。KLF4在胃癌[4]、前列腺癌[5]表達量顯著降低或缺失。恢復KLF4后能降低前列腺癌細胞活性和生長速度、克隆形成、遷移和侵襲，其低表達是前列腺癌預后不良的重要指標[5]。E-cadherin最重要的生理作用是介導同型上皮細胞黏附和維持組織正常形態結構，E-cadherin表達下降時細胞間黏附力減低，當腫瘤細胞一旦獲得轉移的必要條件時即發生轉移[6]。高侵襲乳腺癌的研究表明E-cadheirn是KLF4的關鍵靶基因，KLF4誘導E-cadherin表達阻滯上皮間質轉化（EMT）而抑制腫瘤轉移[7]。本文通過檢測人前列腺癌組織中KLF4和E-cadherin蛋白的表達水平，探討其與前列腺癌危險因素等級間的關系及臨床意義。

材料和方法

一、臨床資料

回顧性檢測分析2015年1月至2017年1月我院泌尿外科手術切除的臨床及病理資料完整的前列腺癌標本，共56例。所有病例術前未進行放療及內分泌治療，術后病理診斷為前列腺癌。年齡50～67歲（平均64.3歲）；術前PSA分布情況：＜10mg/L 9例，10～20mg/L 26例，＞20mg/L 21例；術前穿刺活檢Gleason評分情況：≤6分6例，7分33例，≥8分17例；臨床分期：≤T2a 9例，T2b 19例，≥T2c 28例。選取同期行TURP的56例BPH患者前列腺組織作對照。

二、方法

KLF4兔抗人多克隆抗體（ab26648）購于英國Abcam公司，E-cadherin（ab6528）鼠抗人單克隆抗體購于Santa Cruz生物有限公司；SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。使用免疫組化SP兩步法檢測KLF4和E-cadherin蛋白的表達。根據廠家提供的試劑盒說明書完成具體實驗步驟：組織標本制作成5μm厚切片，檢測前常規脫蠟水化，經微波修復抗原后使用過氧化酶滅活內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次后山羊血清封閉。滴加一抗（KLF4 1:100 ，E-cadherin 1:100），4℃冰箱過夜，PBS反復沖洗3次后滴加二抗37℃孵育30 min，DAB顯色蒸餾水終止反應，經蘇木精復染后，樹脂封片后顯微鏡下觀察。陰性一抗對照用PBS緩沖液代替，以檢測細胞出現棕黃色顆粒為陽性細胞，以染色細胞＞10%為陽性表達；染色細胞＜10%為陰性表達。BPH組織中KLF4蛋白主要在細胞漿表達，少部分細胞胞核呈陽性反應，而前列腺癌組織中胞漿表達量明顯減少或者只有胞核表達。E-cadherin蛋白在前列腺癌細胞膜表達明顯減少，細胞質出現陽性異常染色或以細胞質為主的染色。

三、統計學處理

對所有統計資料都采用SPSS19.0軟件包進行統計分析，兩組間陽性率的檢驗應用x2檢驗完成，各危險因素指標間兩種蛋白陽性率差異性比較采用行×列表x2檢驗，檢驗水準為P＜0.05；KLF4與E-cadherin蛋白表達（交叉頻數）相關性采用Spearman相關分析。

結 果

《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》（2014年版）中，根據PSA、Gleason分值及臨床分期3項綜合指標將前列腺癌危險度分為低危、中危及高危3個等級[8]。本研究檢測前列腺癌中KLF4與E-cadherin 蛋白的表達水平，研究它們與前列腺癌不同危險因素等級相應指標間關系。

一、KLF4和E-cadherin蛋白在人前列腺癌和BPH組織的表達

本研究中前列腺癌組織的KLF4蛋白陽性表達率為12.5%（7/56），明顯低于BPH組織中表達率75%（42/56），兩者間差異有統計學意義（x2=44.44，P = 0.000）；E-cadherin蛋白在前列腺癌組織中陽性表達率為32.1%（18/56），明顯低于BPH組織中的表達87.5% （49/56），兩者間差異有統計學意義（x2=35.70，P = 0.000），見表1和圖1。

二、前列腺癌組織中KLF4，E-cadherin的表達的相關性

根據KLF4及E-cadherin在前列腺癌組織中表達的分布情況，統計學結果顯示KLF4與E-cadherin表達呈正相關，r =0.527，P＜0.05，見表2。

三、前列腺癌組織中KLF4與E-cadherin蛋白及其與危險級別參數間的關系

56例前列腺癌組織中KLF4蛋白和E-cadherin蛋白呈陽性表達分別為7例及18例。其中KLF4和E-cadherin陽性表達數量在不同PSA分級中的分布情況分別是：＜10mg/L 3例、6例，10～20mg/L 4例、8例，＞20mg/L 0例、4例。KLF4及E-cadherin在不同PSA分級中表達結果顯示兩者與PSA分級有統計學差異（x2分別是6.713，6.592；P分別是0.026，0.037）。KLF4和E-cadherin陽性表達數量在不同Gleason分級中的分布情況分別是：≤6分 2例、12例，7分 4例、5例，≥8分 1例、1例。KLF4及在不同Gleason分級中進行統計學分析，結果顯示KLF4蛋白與Gleason分級無統計學差異（x2=0.530，P=1），但E-cadherin蛋白表達與Gleason分級有統計學差異x2=15.453，P=0.000）。KLF4、E-cadherin陽性表達數量在不同臨床分期中的分布情況分別是：≤ T2a期 5例、12例，T2b期2例、5例，≥T2c期0例、2例，KLF4及E-cadherin在不同臨床分期中進行統計學分析，結果顯示均有統計學差異（x2分別是8.936，16.598；P分別是0.007，0.000）（見表3）。

圖1 人前列腺癌和BPH組織中KLF4和E-cadherin蛋白的表達（SP法，×400）

表1 KLF4和E-cadherin在前列腺癌組織中及BPH中的表達

表2 前列腺癌中KLF4和E-cadherin蛋白表達的相關性

表3 KLF4與E-cadherin蛋白在前列腺癌各危險因素中的表達情況及相關性

討 論

前列腺癌是發達國家男性最常見的惡性腫瘤，來自美國癌癥協會數據顯示前列腺癌的死亡率僅次于肺癌，成為第二位致死性惡性腫瘤[9]。前列腺癌的治療包括根治性切除術、放療、化療及去勢術，為了更好的選擇治療方案及對預后進行判斷，術前根據血清PSA 、Gleason 評分和臨床分期將前列腺癌分為低、中、高危三個等級。隨著前列腺癌危險因素等級升高患者預后越差，對危險因素相關的基因蛋白深入研究對提高前列腺癌的早期診斷和預后判斷非常必要。

生理狀態下KLF4對皮膚屏障形成、維持胃腸道上皮穩態以及胃腸道上皮細胞增殖與分化[10]等方面發揮重要的作用，若敲除胃腸道上皮細胞內的KLF4后，上皮表現為異常增殖、分化改變及易受射線傷害[11]。有研究證明轉錄因子KLF4參與腫瘤干細胞的維持而與造成腫瘤細胞增殖、分化、侵襲及轉移等惡性生物學行為相關[12,13]，KLF4屬于組織依賴型基因，既可抑制腫瘤生長也可以扮演癌基因[2,3]，在消化道腫瘤及前列腺癌中KLF4屬于抑癌基因[4,5]，并且KLF4是前列腺癌預后不良的標志物之一。本報道結果顯示56例前列腺癌中僅7例（12.5%，7/56）KLF4蛋白表達陽性，與相同BPH組織（75%，42/56）相比兩者間存在差異。KLF4在不同危險因素中的分布情況顯示，KLF4陽性表達數量在不同PSA分級中的分布情況分別是：＜10mg/L 3例，10～20mg/L 4例，＞20mg/L 0例，KLF4在不同PSA分級中進行比較，結果表明有統計學差異（x2=6.713，P= 0.026）。這一結果目前尚未見相關文獻報道，但兩者各自表達變化的精確程度、可能機制及相關性研究需更大數量的病例及細胞變化內進一步驗證。KLF4表達水平與Gleason分值間無統計學意義（x2=0.530，P=1）；KLF4對臨床分期這一危險因素的預測價值，免疫組織化學（IHC）檢測結果顯示KLF4陽性表達數量在≤T2a期、T2b期及≥T2c期分別是5例、2例及0例，統計學結果顯示不同臨床分期中KLF4表達率有統計學差異（x2=8.936，P= 0.007）。這表明隨著臨床分期越晚KLF4蛋白表達越低，結合PSA及臨床分期情況提示KLF4是前列腺癌預后重要的預測指標。

E-cadherin蛋白主要表達于上皮細胞內，介導同型細胞黏附及維持組織的形態。上皮來源的惡性腫瘤中E-cadherin都呈低表達，與腫瘤細胞發生遠處轉移密切相關；分子機制顯示E-Cadherin表達減少參與了上皮間質轉化（EMT）是誘導腫瘤轉移最關鍵步驟[14]。侯鑄等[15]發現前列腺癌中E-cadherin表達減少。E-cadherin在BPH組織上皮呈強陽性表達，前列腺癌組織表達明顯減弱，本實驗顯示18例前列腺癌組織中E-cadherin蛋白表達呈陽性（18/56，32.1%），與BPH組織（87.5%，49/56）相比兩者間存在差異（x2=35.70，P= 0.000）。在不同危險因素中的分布情況顯示，E-cadherin陽性表達數量在不同PSA分級中的分布情況分別是：＜10mg/L 6例，10～20mg/L 8例，＞20mg/L 4例，E-cadherin在不同PSA分級中進行統計學分析，結果有統計學差異（x2=6.592，P=0.037）；Gleason分級中結果顯示≤6分、7分及≥8分 E-cadherin表達陽性分別為12例、5例及1例，隨著Gleason分值增加E-cadherin蛋白的表達逐漸降低，并且差異具有統計學意義（x2=15.453，P=0.000）。前列腺癌Gleason分級越高細胞形態學異型性不斷升高甚至出現壞死組織結構，前列腺組織失去正常上皮結構；E-cadherin是上皮表型最重要的標志物，它隨著上皮細胞減少而呈低表達狀態，因此隨著Gleason分級越高E-cadherin表達越低。不同Gleason分級間E-cadherin表達異常有統計學意義，結合IHC顯示E-cadherin陽性表達數量在≤T2a期、T2b期及≥T2c期分別是10例、6例及2例，不同臨床分期中有統計學差異（x2=16.598，P=0.000）。本次檢測的E-cadhein蛋白表達與前列腺癌組織分化程度及臨床分期間的關系和既往研究結果一致[15]。上述結果表明KLF4及E-cadherin蛋白隨著前列腺癌組織分級降低、腫瘤浸潤深度加深而降低，這一結果提示兩種蛋白表達減少或者缺失與前列腺癌危險因素分級密切相關，是前列腺癌除PSA、Gleason分級及臨床分期等公認的危險因素之外的重要分子標志物，他們的異常表達亦能判定前列腺癌的臨床進展及預后。

本實驗發現前列腺癌組織中KLF4和E-cadherin的表達呈正相關（r =0.527，P＜0.05），提示KLF4和E-cadherin蛋白表達降低在前列腺癌分級中相互促進，它們在前列腺癌中的相互作用很可能同乳腺癌的侵襲轉移一樣，由于E-cadherin的減少引起KLF4表達降低，從而導致癌細胞浸潤和轉移能力增強[7]。前列腺癌的侵襲轉移與上皮-間質轉化（EMT）有著密切的關系，而EMT最重要的標志是E-cadherin蛋白表達量減少或者缺失。前列腺癌組織中E-cadherin、KLF4蛋白低表達在前列腺癌進展過程中發揮重要作用，聯合檢測E-cadherin和KLF4蛋白可以更有效的判斷前列腺癌侵襲轉移生物學特性。現在推測可能的機制是E-cadherin蛋白的減少引起KLF4表達降低，從而導致癌細胞浸潤甚至發生轉移的能力增強，在前列腺癌中KLF4和E-cadherin變化及可能機制需在分子水平及體內實驗進一步證實。

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