京尼平苷對LPS誘導的星形膠質細胞活化及炎性反應的抑制作用

張 冷，葉 齊，徐之良*

(1.武漢大學人民醫院兒科，武漢 430060；2.福建農林大學生命科學學院，福州 350002)

星形膠質細胞作為中樞神經系統中含量最豐富的膠質細胞群，對神經元起著保護、支持和營養的作用[1]。近年來研究發現，星形膠質細胞上表達有多種受體，對中樞神經系統的調節起著重要作用。激活的星形膠質細胞可釋放多種致炎細胞因子和趨化因子，作用于小膠質細胞和神經元，可直接引起或擴大炎癥反應[2]。因此，通過調節星形膠質細胞上的相關受體抑制星形膠質細胞活化，從而抑制神經炎癥反應，對多種神經系統疾病具有重要意義[3]。

京尼平苷是茜草科(Rubiaceae)植物梔子(GardeniajasminoidesEllis) 的主要成分，為環烯醚萜葡萄糖苷類化合物。文獻報道，京尼平苷具有多種藥理活性，包括抗炎鎮痛、保肝利膽、神經營養和保護、降血糖以及調血脂等作用[4]。有報道表明，京尼平苷對神經炎癥具有較好的調節作用[5]，但其作用機制尚不完全清楚。因此，本研究探索京尼平苷對LPS誘導的星形膠質細胞炎性反應的抑制作用及分子機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 CO2恒溫培養箱(美國Thermo Scientific公司)；潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(美國BioTek Instruments公司)；熒光正置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2試藥 京尼平苷(GE)，質量分數大于 98%，批號140815，南京狄爾格醫藥科技有限公司；白藜蘆醇(RES)，質量分數大于99%，武漢欣欣佳麗生物科技有限公司；DMSO和LPS，購于Sigma公司；DMEM/F12培養基，HyClone公司；Anti-GFAP antibody(ab7260)、TNF-α、IL-6和 IL-1β， ELISA檢測試劑盒(美國Abcam公司)；BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

1.3動物 清潔級雄性SD乳鼠，許可證號：SCXK(滬)2012-0002，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。

2 方法

2.1原代星形膠質細胞的分離、培養和鑒定 取出生1～3 d 的SD乳鼠，斷頭后剪開顱骨，取大腦皮層，剝離腦膜及血管，剪碎大腦皮層，用質量分數為0.25%的胰酶消化，以1 000 r·min-1離心，棄上清液，用質量濃度為100 g·L-1FBS的DMEM/F12 培養基洗滌、重懸，200目篩網過濾，置于37 ℃、體積分數為5% 的CO2培養箱中，差速黏附去除成纖維細胞。繼續培養并純化后，細胞爬片進行GFAP免疫熒光染色鑒定純度。

2.2分組及給藥處理 將原代培養的星形膠質細胞隨機分為5組：對照組加入含質量濃度為100 g·L-1FBS的DMEM/F12 培養基；LPS組加入含終質量濃度為1 μg·mL-1的LPS培養基；藥物處理組細胞預先加入相應終濃度為50 μmol·L-1的白藜蘆醇或0.1，1和10 μmol·L-1的京尼平苷作用12 h后，再置于終質量濃度為1 μg·mL-1的LPS培養基中培養24 h。

2.3酶聯免疫吸附法(ELISA) 各處理組星形膠質細胞用含1 mmol·L-1PMSF 的NP-40 裂解液裂解，置于4 ℃ 低溫離心機中，以12 000 r·min-1離心5 min，上清液為總蛋白，用BCA法測定蛋白質量濃度。根據ELISA試劑盒說明書方法測定各細胞因子的含量。

2.4Western Blot法 各組星形膠質細胞按照ELISA法提取蛋白，配制質量濃度分別為120和50 g·L-1的分離膠和濃縮膠，上樣后進行電泳，待酚藍跑到凝膠底部時即可停止電泳，使用PVDF膜進行轉膜，轉膜時恒壓100 V，時間為1.5 h；用質量濃度為50 g·L-1的脫脂奶粉封閉液室溫封閉1～2 h,用一抗4 ℃冰箱的搖床孵育過夜(GFAP，1∶20 000；NF-κB，1∶1 000；GAPDH，1∶20 000)；繼而二抗室溫孵育1～2 h，清洗后用ECL發光液發光顯影，用Image J對蛋白條帶的灰度進行量化統計，GAPDH為內參蛋白。

3 結果

3.1原代星形膠質細胞鑒定 GFAP是星形膠質細胞骨架蛋白，特異性表達于星形膠質細胞，通過免疫熒光細胞化學法鑒定星形膠質細胞純度。藍色熒光為DAPI染的細胞核，紅色熒光為GFAP，星形膠質細胞純度=星形膠質細胞數(紅色熒光標記)/細胞總數(藍色)×100%。隨機挑選5個視野統計結果。結果顯示，GFAP陽性細胞數為95%以上，可用于后續實驗。見圖1。

3.2京尼平苷對LPS誘導星形膠質細胞活化的影響 采用Western Blot法，以GFAP蛋白水平為指標，觀察京尼平苷對LPS誘導星形膠質細胞的活化作用。結果見圖2。由圖2可知，與對照組比較，LPS模型組GFAP蛋白水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；陽性對照組白藜蘆醇顯著降低GFAP蛋白水平(P<0.01)；京尼平苷可抑制LPS誘導的GFAP蛋白水平增高，與LPS組比較，京尼平苷處理后GFAP蛋白水平下降，1 μmol·L-1京尼平苷的作用較弱(P<0.05)，10 μmol·L-1的京尼平苷能抑制GFAP蛋白水平升高(P<0.01)，0.1 μmol·L-1京尼平苷未能抑制GFAP蛋白水平(P>0.05)。

圖1大鼠大腦皮層原代培養星形膠質細胞免疫熒光圖

Fig.1 Immunofluorescence of primary cultured astrocytes from rat cerebral cortex

圖2京尼平苷對LPS誘導星形膠質細胞GFAP的影響

注：與對照組比較##P<0.01；與LPS組比較*P<0.05，

**P<0.01。

Fig.2 Effects of geniposide on LPS-induced GFAP activities in astrocytes

Note:##P<0.01 vs control group；*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

3.3京尼平苷對LPS誘導星形膠質細胞致炎細胞因子的影響 與對照組比較，LPS誘導原代星形膠質細胞24 h后，細胞上清液IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白水平顯著升高(P<0.01)；LPS+白藜蘆醇組顯著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白水平(P<0.01)，而京尼平苷各處理組對IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白水平呈質量濃度依賴性抑制作用，但與LPS組比較，低濃度京尼平苷組差異無統計學意義(P>0.05)，中、高濃度組均可顯著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白水平(P<0.01)。見表1。

表1京尼平苷對LPS誘導星形膠質細胞致炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

Tab.1 Effects of geniposide on protein expression of IL-1β，IL-6 and TNF-αin LPS induced astrocytes

組別IL-1βlevel/ng·L-1IL-6level/ng·L-1TNF-αlevel/ng·L-1空白對照組8.4±1.71.4±0.212.8±0.48LPS組127.4±11.9##13.4±2.7**17.2±2.2##LPS+RES組(50μmol·L-1)63.7±7.8**4.4±0.85**4.1±1.8**LPS+GE組(0.1μmol·L-1)118.6±7.19.8±2.116.4±3.2LPS+GE組(1μmol·L-1)88.6±9.5*7.4±1.2**11.4±1.8**LPS+GE組(10μmol·L-1)72.8±8.8**5.4±0.4**4.6±1.9**

注：與對照組比較**P<0.01；與LPS組比較#P<0.05，##P<0.01。

3.4京尼平苷對LPS誘導星形膠質細胞NF-κB p65蛋白水平的影響 LPS誘導的星形膠質細胞NF-κB p65水平顯著升高，與LPS組比較，LPS+白藜蘆醇組顯著降低NF-κB p65水平，而低濃度京尼平苷組對NF-κB p65蛋白水平影響不大，中、高濃度京尼平苷組可顯著降低其表達水平(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

圖3京尼平苷對LPS誘導星形膠質細胞NF-κBp65的影響

注：與對照組比較##P<0.01；與LPS組比較*P<0.05，**P<0.01。

Fig.3 Effects of geniposide on protein expression of NF-κB p65 on LPS induced astrocytes

Note:##P<0.01 vs control group；*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

4 討論

神經膠質細胞介導的中樞神經系統炎癥在多種疾病中起著重要作用，如神經病理性疼痛、阿爾茲海默癥和類風濕性關節炎等[6]。星形膠質細胞是神經系統中數量最多的膠質細胞，可通過小膠質細胞和神經元形成神經免疫網絡，發揮病理、生理功能[7]。在多種疾病狀態下，星形膠質細胞會活化，釋放大量致炎細胞因子和趨化因子等啟動并促進炎癥反應的進展[8]。多種神經炎癥相關疾病的發病機制尚不清楚，缺乏有效的治療措施和藥物，或因某些藥物嚴重的毒性和不良反應限制其臨床應用。因此，尋找新靶點和新作用機制的藥物具有重要意義。

京尼平苷是中藥梔子中環烯醚萜苷類的化學成分，有文獻通過細胞或動物實驗證實，京尼平苷對多種神經炎癥相關疾病有較好的作用[9]，如阿爾茲海默癥、糖尿病和類風濕性關節炎等。鑒于其較好的抗炎活性，本實驗在原代培養的大鼠皮層星形膠質細胞上證明其抗炎活性及可能機制。GFAP是一種主要存在于星形膠質細胞中的中間絲蛋白，也是星形膠質細胞的骨架蛋白，其表達水平可用于判斷星形膠質細胞的活化情況[10]。本實驗通過觀察GFAP水平變化，發現LPS可誘導星形膠質細胞活化，而1 和10 μmol·L-1京尼平苷可顯著抑制其活化。此外，ELISA實驗證實LPS還可使星形膠質細胞活化后的IL-1β、IL-6和TNF-α等致炎細胞因子水平顯著升高，而京尼平苷可抑制這些細胞因子的升高。TNF-α、IL-1β和IL-6是較常見的致炎細胞因子，可激活放大多種炎癥反應，參與體內炎癥反應、細胞生存、生長、分化和細胞凋亡等多種重要的病理生理反應[11-12]。文獻報道，京尼平苷在類風濕性關節炎大鼠模型及阿爾茲海默癥小鼠模型上可顯著抑制TNF-α和IL-1β水平[9，13]，這與本實驗結果相吻合，本實驗從細胞水平進一步明確了京尼平苷具有較好的抗炎作用。同時，實驗還檢測到京尼平苷可顯著抑制NF-κB p65蛋白的活化。NF-κB p65蛋白是一種廣泛存在于真核細胞中的轉錄因子，其活化能調控一系列基因的表達[14]，如炎性細胞因子TNF-α和IL-1β等，引發炎癥級聯反應[15]，加速細胞凋亡，直接或間接地參與一系列病理過程[16]。因此，京尼平苷可通過抑制NF-κB途徑降低致炎細胞因子水平，達到抗炎作用。

膠質細胞介導的神經炎癥反應是研究的熱點，抑制星形膠質細胞過度活化是有效手段之一[17]。本實驗觀察到京尼平苷可抑制星形膠質細胞活化，致炎細胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的水平以及NF-κB p65蛋白活化。基于上述情況，推測京尼平苷抗慢性炎性作用可通過NF-κB途徑抑制LPS誘導的星形膠質細胞活化，并抑制致炎細胞因子水平，該作用可能與京尼平苷抗類風濕性關節炎、阿爾茲海默癥等神經炎癥疾病具有一定關系。本實驗為京尼平苷治療相關炎癥性疾病提供了理論依據。

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