細胞膜色譜技術應用于中藥活性成分篩選的研究進展

徐 碩，姜文清，鄺詠梅，徐文峰，金鵬飛

(北京醫院藥學部，國家老年醫學中心，藥物臨床風險與個體化應用評價北京市重點實驗室，北京 100730)

生物膜上存在多種活性蛋白，細胞通過膜上的受體和離子通道等信息靶點與其他細胞、組織進行信息傳遞、交流、分析、綜合，維持機體內外環境的平衡，實現生命活動[1]。細胞膜上的受體、通道能選擇性地識別藥物中的化學成分并與之特異性結合，通過影響細胞內第2或第3信使分子導致一定的生物效應，最終產生藥理作用[2]。

細胞膜色譜法(cell membrane chromatography，CMC)是將活性組織細胞膜固定在特定載體表面，制備成細胞膜固定相，以緩沖溶液為流動相，將藥物添加在流動相中，利用色譜學技術研究藥物與固定相之間作用規律的受體動力學新方法[3-4]。

CMC技術在中藥活性成分的研究中具有優勢，本文綜述了CMC技術在中藥活性成分篩選應用中的研究進展，以期為進一步發展該技術提供參考。

1 CMC的基本原理和特點

CMC與高效液相色譜(HPLC)、細胞生物學和受體藥理學等內容相結合，運用藥物與膜受體之間的特異性親和力，將藥物在體內的作用過程在色譜柱內進行動態模擬。研究藥物與固定相上細胞膜和受體的相互作用，獲得如容量因子k′和不對稱因子As等色譜參數，可為闡明藥物的作用機制、藥物與受體親和作用以及新藥開發等方面提供參考[5-6]。

2 在中藥活性成分篩選中的應用

近年來，CMC在中藥活性成分篩選研究中的應用涉及到多個方面，見表1。

2.1抗炎鎮痛活性成分的篩選 王建寰等[7]從老瓜頭二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位分得4個化合物，正丁醇部位分得2個化合物，總生物堿中分得1個化合物。采用 SD 大鼠大腦皮層細胞制備細胞膜固定相，初篩了老瓜頭的鎮痛抗炎活性部位和活性成分，結果表明，華北白前醇、老瓜頭總生物堿和7-脫甲氧基娃兒藤堿可較強結合SD大鼠大腦細胞膜上的受體或靶點，但其作用靶點和機制有待于進一步深入研究。

5-羥色胺(5-HT)受體在偏頭痛發病中起重要作用。杜暉等[8]通過大鼠紋狀體組織獲得色譜固定相，運用細胞膜色譜結合液相色譜技術，特異性地識別川芎-白芷藥對中可與固定相上受體相互作用的配體，發現歐前胡素是其潛在的活性成分。以不同濃度5-HT1D受體激動劑舒馬普坦為模型藥物，采用硝酸甘油致大鼠偏頭痛模型對生物活性進行驗證。

表1CMC技術應用于中藥活性成分篩選的不同細胞膜類型

Tab.1 Application of CMC technique in different cell membrane types for screening bioactive components from traditional Chinese medicine

活性成分類型細胞膜類型中藥抗炎鎮痛大腦皮層細胞膜老瓜頭[7]紋狀體組織細胞膜川芎-白芷藥對[8]抗心血管疾病CD40高表達細胞膜丹參[9]β1腎上腺素受體(β1-AR)細胞膜羌活[10]、夏天無[11]血管平滑肌細胞膜白芷、羌活、北沙參、蛇床子[12-13];五味子、南五味子[14];佛手[15];當歸[16]心肌細胞膜川芎[17]、附子[18-19]抗糖尿病胰島β細胞膜黃連[20]抗腫瘤人肝癌HepG2細胞膜苦參[21]人乳腺癌MDA-MB-231細胞膜厚樸[22]成纖維細胞生長因子受體4(FGFR4)細胞膜白芥子[23]紅細胞膜金刷把[24]血管內皮生長因子受體(VEGFR-2)高表達細胞膜烏頭[25]表皮生長因子受體(EGFR)高表達細胞膜馬錢子[26]SMMC-7721細胞、HepG2細胞鴉膽子[27]成骨牙周韌帶細胞膜黃連[28]抗過敏嗜堿性粒細胞性白血病RBL-2H3細胞膜胡椒[29]、紅花[30]

2.2抗心血管疾病活性成分的篩選 林蓉等[9]對丹參中抗動脈粥樣硬化的活性成分進行了篩選。通過建立CD40高表達的內皮細胞(ECV-304)，得到細胞膜固定相，即利用CD40高表達的內皮細胞膜色譜模型進行研究。結果表明，丹參脂溶性和水提取部位均與CD40高表達細胞膜具有親和作用，從這2個部位中分得的丹參酮ⅡA、丹參酮ⅠA和丹參素為其活性成分。

心肌組織中主要分布β1-AR。在臨床中,β1-AR受體阻滯劑是治療心肌缺血、心肌梗死和慢性心臟衰竭等疾病的常用藥物。Yue Y等[10]采用高表達β1-AR的中國倉鼠卵巢細胞 CHO-S，構建了CMC體系，篩選羌活中作用于β1-AR的活性成分，結果表明，異歐前胡素為其有效成分。王新等[11]建立了以β1腎上腺素受體(β1-AR)細胞膜色譜與UPLC-MS聯用技術，篩選鑒別夏天無中的活性成分。采用美托洛爾和藥根堿處理β1-AR/CHO-S 細胞24 h，換異丙腎上腺素損傷細胞10 h后，ELISA法測定活性成分對β1-AR下游因子cAMP和PKA水平的影響，評價其對β1-AR的抑制作用。結果表明，藥根堿是夏天無中具有β1-AR抑制作用的活性成分，β1-AR/CMC-offline-HPLC/MS分析方法能夠快速且有效篩選出作用靶點明確的活性成分，實驗結果和生物效應具有一致性。

Hou X F等[12]將建立的大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞CMC系統與離線GC-MS技術聯合應用，研究了作用于L-型鈣通道的活性成分。結果從白芷、羌活和北沙參中篩選得到歐前胡素，從蛇床子中篩得蛇床子素，蛇床子素是蛇床子中含量最高的一種羥基香豆素類有效成分[13]。

Yang X等[14]建立了來源于大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞膜色譜，結合HPLC-MS技術，對五味子和南五味子中具有血管擴張作用的成分進行篩選，結果表明，去氧五味子素和五味子酯甲是其活性成分。去氧五味子素能夠競爭性拮抗硝苯地平與細胞膜受體的結合，去氧五味子素與五味子酯甲部分重疊VSM細胞膜的結合位點。體外實驗表明，去氧五味子素和五味子酯甲對大鼠胸主動脈(先用氯化鉀進行處理)具有擴張作用，且呈劑量依賴性。

王艷微等[15]采用大鼠血管平滑肌細胞膜色譜模型(VSM/CMC)篩選，LC-MS離線分析，結合離體藥理實驗確定佛手舒張血管的有效成分。結果顯示，佛手柑內酯具有舒張血管作用。化合物在VSM/CMC的保留特性與其藥理活性的相關性十分顯著，說明化合物與細胞膜和膜蛋白之間的相互作用可通過VSM/CMC模型反映出來。

趙惠茹等[16]對當歸中具有舒張主動脈血管作用的成分進行篩選。采用CMC篩選，TLC法分離，結合體外藥理實驗對活性成分進行確認。結果表明，化合物與細胞膜和膜蛋白之間的相互作用可通過血管CMC模型體現出來，化合物在CMC系統里的保留特性與其藥理活性的相關性十分明顯，當歸具有血管舒張作用的有效部位是其乙醚提取物。

岳宣峰等[17]將家兔心肌細胞膜與硅膠載體進行固定，通過比對川芎水提液、醇提液與心肌細胞膜上已知受體的部分激動劑和拮抗劑在心肌細胞膜色譜柱中的保留特性，對川芎提取液和心肌細胞膜受體的相互作用進行探討。結果表明，水提液和醇提液均能在心肌細胞膜色譜柱上得到保留，β1受體激動劑不影響水提液的保留特性，而這種特性受到α受體阻斷劑競爭結合的影響。結果表明，與α受體作用的有效成分存在于川芎水提液中，而水提液中沒有與β1受體作用的有效成分，與心肌細胞膜受體作用的成分也存在于醇提液中。

中醫將附子用于“回陽救逆”，研究表明，去甲烏藥堿是附子的強心成分[18]。曹巖等[19]通過CMC和HPLC-TOF/MS技術相結合，對附子中的活性成分進行初步篩選和鑒定。采用大鼠心肌細胞膜色譜柱，以10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液為流動相，色譜分離采用C18柱，以1 mL·L-1甲酸水溶液-乙腈為流動相，利用質譜對化合物進行鑒定，結果顯示，苯甲酰烏頭胺和苯甲酰新烏頭胺和苯甲酰次烏頭胺等8種成分可能是附子中的活性成分。

2.3抗糖尿病活性成分的篩選 磺酰脲受體(SUR)分布于胰島β細胞膜上，當SUR與磺酰脲藥物相結合之后，可對胰島素的釋放產生促進作用。Tang C等[20]研究了黃連中作用于SUR的活性成分，通過CMC技術，將小鼠胰島細胞和毛細管相結合，得到細胞膜毛細管色譜固定相，結果表明，篩選出的有效成分為小檗堿。

2.4抗腫瘤活性成分的篩選 Chen X等[21]對黃柏和苦參中的抗腫瘤活性成分進行研究，建立了HepG2細胞膜色譜模型，并與質譜技術聯用，結果黃連素和延胡索乙素、苦參堿和氧化苦參堿分別從黃柏和苦參中被篩選出來。這4種成分類似于吉非替尼，能夠作用于HepG2細胞膜上的表皮生長因子受體；通過體外實驗證實：黃連素和延胡索乙素能夠抑制HepG2 細胞的增殖，且這種作用呈濃度依賴性。

Hou X等[22]對厚樸中的抗乳腺癌活性成分進行篩選，MDA-MB-231細胞膜固定相的制備是以硅膠作為載體，與2D LC-MS技術聯用，結果表明，和厚樸酚和木蘭醇是其抗乳腺癌的有效成分。

腫瘤細胞的增殖、生長、侵襲和轉移與成纖維細胞生長因子受體4(FGFR 4)以及FGFR 4信號通路的激活密切相關，可以根據這個特性篩選活性成分。Zhang T等[23]對白芥子中可作用于FGFR 4的化合物進行篩選。通過建立能夠用于識別-篩選-鑒定與FGFR 4相結合成分的二維在線聯用系統，考察FGFR 4/CMC-HPLC/MS體系的專屬性、可靠性和重復性，最終篩選出芥子堿為白芥子中的有效成分。

張博等[24]運用柱色譜技術分離金刷把中的化學成分，通過兔紅細胞膜色譜模型進行篩選，結合MTT比色法，篩選出具有抑制HeLa細胞生長作用的化合物。結果顯示，乙醚萃取部位為具有細胞毒活性的有效部位，從中分得的化合物為活性成分。結果表明，該模型能使細胞毒性成分與細胞膜、膜受體之間的相互作用在分子水平上得以體現，顯著的保留特性可通過色譜過程表現出來。

血管內皮生長因子受體(VEGFR-2)在卵巢癌和甲狀腺癌等腫瘤中過度表達。Li M等[25]通過VEGFR高表達CMC結合HPLC-MS技術，對烏頭中作用于VEGFR-2的有效成分進行篩選，結果表明，次烏頭堿、烏頭堿和海帕烏頭堿為其中的活性成分。

表皮生長因子受體(EGFR)在多種人惡性腫瘤細胞中高表達。Sun M等[26]對馬錢子中具有抗EGFR的活性成分進行篩選。EGFR高表達的HEK293細胞膜固定相是通過以硅膠為載體進行制備，與HPLC-MS技術聯用，篩選出的主要有效成分為馬錢子堿和士的寧。體外實驗表明，馬錢子堿和士的寧能使HEK293/EGFR細胞的增殖以及胞外信號調節激酶(Erk)的磷酸化得到明顯抑制，對下游傳導信號分子的表達也具有抑制作用。

紀松崗等[27]建立了SMMC-7721細胞-鴉膽子和HepG2細胞-鴉膽子的全二維細胞膜色譜-整體柱色譜的高通量活性成分篩選模型，用于篩選鴉膽子油的抗腫瘤活性成分。結果顯示，腺苷和鴉膽子苦素B可能是其活性成分。

2.5成骨活性成分的篩選 Liu J等[28]通過牙周韌帶細胞膜色譜，結合實時在線質譜技術，篩選出其潛在的成骨活性成分為黃連素。黃連素可作用于人牙周韌帶細胞，對人牙周韌帶細胞的生長具有促進作用，并能使細胞培養基中ALP 的分泌增加，促進礦化結節的形成。

2.6抗過敏活性成分的篩選 Ⅰ型超敏反應的發生需要免疫球蛋白E(IgE)的參與，與IgE高親和力受體FcεRI 結合能導致肥大細胞脫顆粒并使炎性介質釋放。Huang J等[29]研究了胡椒中作用于FcεRI受體的成分，CMC系統的構建是通過大鼠嗜堿性粒細胞性白血病細胞RBL-2H3完成的，并聯用HPLC-MS技術對篩選出的成分進行鑒定，結果表明，胡椒堿為其中作用于FcεRI受體的活性成分。Han S 等[30]利用相同的系統，篩選出紅花中的抗過敏活性成分，結果顯示，羥基紅花黃色素A為其有效成分。

3 結語

中藥具有非常復雜的化學成分，對其藥效物質基礎進行研究是目前科研工作者研究的熱點問題之一。中藥活性成分的篩選是闡明其藥效物質基礎及開發新藥的重要工作。實現中藥現代化研究迫切需要適合于中藥復雜體系的新研究策略。應用CMC技術可較快地篩選出活性成分，結合制備型HPLC，對成分進行富集，在實驗過程中通過加入陽性對照藥物或工具藥進行驗證，使得實驗得到的結果更加可靠。

CMC技術是一種從中藥復雜體系中篩選活性成分的方法，具有多方面的優點，但也存在一定局限性。①CMC技術作為一種離體的活性成分篩選方法，不能使復雜的體內環境和體內其他影響中藥藥效發揮的因素被完全模擬出來。因此，采用CMC篩選活性成分時，需根據藥物的體內代謝過程不斷完善藥理模型。②不同的中藥活性成分在體內的作用靶點不同，制備生物材料的固定相細胞膜具有一定難度，不能完全保證實驗的精密度和重復性，且存在保存時間短、難以實現商品化的問題。③多種活性蛋白存在于自然生物膜上，但標本量太少或收集困難，不能將此類生物膜用于大規模篩選和受體亞型的研究。解決該問題的方法是將重組受體和藥物篩選相結合，將受體的配基、亞基和靶酶的活性中心等在細胞株或微生物中大量表達[31]。④CMC體系中，如果細胞膜對硅膠(固定相載體)包裹不全，可能由于硅膠的吸附性，使藥物與細胞膜、膜受體之間的相互作用受到干擾。⑤被CMC柱特異性保留的有效成分的量通常很少，難以進行結構鑒定和藥理活性確證。為解決該問題，可通過受體高表達細胞株的膜色譜制備，構建各種單一受體高表達的CMC體系，聯用HPLC法、LC-MS法、光譜法、蛋白質組學等技術，建立細胞膜篩選平臺以用于藥物高通量篩選。

因此，對于CMC技術還需進行深入探索，充分利用其優勢，使該技術在中藥活性成分的篩選以及發現更多高效低毒的先導化合物方面發揮越來越大的作用。

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