基于當(dāng)歸多糖的酶敏腫瘤靶向納米遞藥體系的研究

王敏哲，賀 欣，楊鐵虹

(空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物分析學(xué)教研室，西安 710032)

當(dāng)歸為傘形科植物Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛及潤(rùn)腸通便等功效[1]。當(dāng)歸多糖(Angelicasinensispolysaccharide，AP)是從中藥當(dāng)歸中提取的主要成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，AP具有促進(jìn)造血、抗血栓和抗輻射等多種藥理活性[2-3]，特別是在抗腫瘤[4-5]和免疫調(diào)節(jié)[6-8]方面具有獨(dú)特療效。

目前，納米遞藥系統(tǒng)(Nano drug delivery systems,NDDS)已成為研究腫瘤治療的熱點(diǎn)方向[9-10]。其中腫瘤微環(huán)境響應(yīng)型納米遞藥系統(tǒng)，可利用腫瘤微環(huán)境中獨(dú)特的性質(zhì)，如較低的酸度[11]、較強(qiáng)的還原性[12]和各種酶的特異性高表達(dá)[13]等，實(shí)現(xiàn)化療藥物的智能靶向釋放[14]。近年研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在人類多種腫瘤組織中都有特異性高表達(dá)[15]，是構(gòu)建腫瘤微環(huán)境酶響應(yīng)型靶向納米遞藥體系的潛在靶點(diǎn)。

另外，天然多糖具有安全無毒、水溶性好、生物相容性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為理想的藥物載體[16-18]。其中AP作為納米藥物載體也具有良好的發(fā)展前景。例如陳曉颙等[19]通過當(dāng)歸多糖包覆在Fe3O4表面構(gòu)建磁性納米粒子，并負(fù)載5-Fu，結(jié)果表明,AP是一種良好的納米藥物載體。徐希明等[20]將AP進(jìn)行陽離子化后通過靜電吸附帶負(fù)電荷的DNA質(zhì)粒，同樣證實(shí)AP是一種理想的藥物載體。因此，本研究以AP為藥物載體，負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)，制備腫瘤微環(huán)境酶敏型納米遞藥體系，即AP-PP-DOX，見圖1，并初步研究其理化性質(zhì)和體外抗腫瘤效果。

圖1AP-PP-DOX納米粒作用示意圖

Fig.1 The schematic diagram of the AP-PP-DOX nanoparticles

1 儀器與試藥

1.1儀器 DF-Ⅱ型集熱式磁力攪拌器(江蘇金壇億能實(shí)驗(yàn)儀器廠)；FT-IR 8400紅外光譜儀(日本島津公司)；BECKMAN DU640紫外分光光度計(jì)(北京譜飛科技有限公司)；真空干燥箱(大連第四儀表廠)；JEM-2000EX型透射電鏡(日本Hitachi公司)；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀(英國(guó)Malven儀器有限公司)；Avance DMX500核磁共振儀(Bruker公司)；ZYJ-L超凈工作臺(tái)(張家口市空氣凈化工程公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Heareus公司)。

1.2試藥 當(dāng)歸多糖(AP，MW 50-100KD，自制)；基質(zhì)金屬蛋白酶敏感肽(PP，序列NH2-GPLGIAGQC-SH，MW814)，人重組MMP-2酶(MW72KD)，均購(gòu)自上海昕浩生物科技有限公司；膠原酶潛酶活化劑(APMA)，購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；DOX·HCl、SMP、EDC和NHS,均購(gòu)自Sigma公司；馬來酸酐(MA)，購(gòu)自上海行知化工廠；三乙胺(TEA)，購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)，購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胰蛋白酶和胎牛血清，均購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。

2 方法

2.1馬來酰化當(dāng)歸多糖(AP-MA)的合成 參考文獻(xiàn)[21]方法，稱取一定量AP，溶解在適量LiCl/DMF(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %)溶液中，加熱至完全溶解；降溫至60 ℃，依次加入催化劑TEA和MA，氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用異丙醇重結(jié)晶，得到白色沉淀，將沉淀溶解在一定量水中透析(相對(duì)分子質(zhì)量8 000～14 000)，凍干得到白色絨毛狀產(chǎn)物即為AP-MA。

2.2當(dāng)歸多糖-基質(zhì)金屬蛋白酶敏感肽(AP-PP)的合成 參考文獻(xiàn)[22]方法，首先稱取一定量的AP-MA，溶于pH值為8.0的碳酸鹽緩沖溶液中，加入EDC和NHS，室溫反應(yīng)2 h活化羧基；然后將一定量PP(AP-MA和PP摩爾比為1∶1.2)溶解后滴入上述溶液中，在4 ℃冰浴及氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下反應(yīng)8 h，反應(yīng)結(jié)束后將上述反應(yīng)液移入透析袋(相對(duì)分子質(zhì)量8 000-14 000)中，在去離子水中透析24 h，除去未反應(yīng)的PP及雜質(zhì)，最后將上述溶液凍干，即得。

2.3當(dāng)歸多糖-基質(zhì)金屬蛋白酶敏感肽-阿霉素(AP-PP-DOX)的合成 參考文獻(xiàn)[23]方法，首先將一定量的DOX·HCl和SMP(摩爾比1∶1.2)溶于適量DMF中，加入TEA(DOX·HCl和TEA摩爾比為1∶3)，在避光、室溫條件下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入冰乙醚得紅色沉淀，反復(fù)洗滌沉淀3次，再以12 000 r·min-1離心30 min，最后將沉淀真空干燥即得DOX-SMP。將一定量的凍干品AP-PP和DOX-SMP(摩爾比1∶1.2)溶于適量DMF中，加入TEA(DOX·HCl和TEA摩爾比為1∶3)，在避光、室溫條件下反應(yīng)8～12 h。反應(yīng)結(jié)束后將上述反應(yīng)液移入透析袋(相對(duì)分子質(zhì)量8 000-14 000)中，在去離子水中透析48 h，去除未反應(yīng)物質(zhì)及雜質(zhì),最后將上述反應(yīng)液凍干，即得。

2.4結(jié)構(gòu)表征 分別采用FT-IR和1H-NMR對(duì)各步反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行表征。

2.5AP-PP-DOX納米粒的制備 稱取10 mg AP-PP-DOX凍干品，溶于2 mL DMSO中，在去離子水中透析(相對(duì)分子質(zhì)量8 000-14 000)48 h，透析結(jié)束后，超聲震蕩2 min，在10 mL量瓶中定容，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.6納米粒粒徑和電位的測(cè)定 稱取一定量的AP-PP-DOX納米粒，溶于一定量PBS溶液中，超聲震蕩2 min，利用粒度分析儀(DLS)進(jìn)行粒徑和電位測(cè)定。

2.7TEM觀察納米粒形態(tài) 將樣品稀釋數(shù)倍后超聲分散，0.45 μm濾膜過濾，滴于銅網(wǎng)上，室溫干燥過夜，TEM觀察納米粒形態(tài)。

2.8載藥量的測(cè)定 稱取10 mg AP-PP-DOX納米粒溶解于10 mL pH值為7.4的PBS溶液中，質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1。取上述溶液1 mL，加入0.1 mmol·L-1稀鹽酸1 mL破壞納米粒，以12 000 r·min-1離心30 min。取離心后上清液用紫外分光光度計(jì)在480 nm處測(cè)定DOX吸光度值；利用DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DOX含量。利用公式計(jì)算載藥量：

2.9體外模擬釋藥 配制一定質(zhì)量濃度的AP-PP-DOX納米粒溶液，并加入一定量MMP-2酶(預(yù)先用APMA活化)，使納米粒溶液終質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1，酶終濃度為10 nmol·L-1。將上述溶液等分為8份，于37 ℃震蕩孵育，并分別在1,2,4,6,8,10,16和24 h 8個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出1份加入稀醋酸終止酶解反應(yīng)，通過透析后取透析外液利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DOX的含量，并繪制DOX釋藥曲線；同法配制酶終濃度為20和40 nmol·L-1以及不加酶納米粒，并繪制釋藥曲線。

2.10細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將指數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞配制成5×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，按照每孔100 μL接種到96孔板上，在37 ℃、CO2含量為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄掉舊液，將含有不同質(zhì)量濃度(0.03,0.1,0.3,1,3和9 μg·mL-1)的DOX、AP-PP-DOX或AP-PP-DOX+MMP-2(20 nmol·L-1)培養(yǎng)基，按照每孔100 μL加入96孔板，每種濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白和對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光條件下每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h形成藍(lán)色甲瓚結(jié)晶，取出細(xì)胞，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，在平板搖床上震蕩10 min，溶解藍(lán)色結(jié)晶，后用酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)吸光度值A(chǔ)，依據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

3 結(jié)果

3.1結(jié)構(gòu)表征 見圖2～6。由圖2可知，AP在3 386 cm-1處強(qiáng)吸收峰為糖分子中的O-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收，2 908 cm-1處的峰是糖分子中C-H彎曲振動(dòng)吸收，這些均是糖類特征吸收峰；1 608 cm-1處是糖分子中C=O鍵的伸縮振動(dòng)峰。AP-MA在3 386 cm-1處仍保留有多糖特征吸收峰，在1 735 cm-1處為AP和MA形成的酯鍵C=O的伸縮振動(dòng)峰，結(jié)果表明，AP和MA成功反應(yīng)生成AP-MA。

圖2AP和AP-MA紅外圖譜

Fig.2 FT-IR spectra of AP and AP-MA

圖3AP和AP-MA核磁氫譜圖

Fig.31H-NMR spectra of AP and AP-MA

由圖3可知，AP-MA在a處(6.2～6.5 ppm)形成的新峰對(duì)應(yīng)多糖上引入MA后形成的雙鍵(-HC=CH-)的質(zhì)子峰；b處(3.5～4.0 ppm)保留有多糖上特征氫峰，與圖2相對(duì)應(yīng)，結(jié)果表明，AP-MA成功合成。

由圖4可知，AP-PP上a處(4.25～4.50 ppm)是多肽PP形成的肽鍵-NCHCO-的特征性質(zhì)子峰；b處(0.80～1.20 ppm)出現(xiàn)了多肽PP上-CH3質(zhì)子峰；c處(3.5～4.0 ppm)是多糖上的特征性質(zhì)子峰。結(jié)果表明，AP-PP的成功合成。

圖4AP-MA和AP-PP核磁氫譜圖

Fig.41H-NMR spectra of AP-MA and AP-PP

圖5DOX、SMP和DOX-SMP紅外圖譜

Fig.5 FT-IR spectra of DOX，SMP and DOX-SMP

由圖5可知，SMP紅外中3 500 cm-1處是含胺類物質(zhì)特征吸收峰；DOX紅外中3 313和3 525 cm-1均是-OH特征吸收峰，1 600 cm-1附近出現(xiàn)-C=O-特征吸收峰；DOX-SMP紅外中在3 394和1 639 cm-1處出現(xiàn)了新的峰，分別是酰胺鍵的-NH-特征性伸縮振動(dòng)吸收峰和酰胺Ι譜帶C=O特征性伸縮振動(dòng)吸收峰，證明了DOX-SMP的成功合成。

由圖6可知，a處(7.78 ppm)是DOX蒽環(huán)質(zhì)子峰，b處(1.75 ppm)是DOX中-CH2-質(zhì)子峰；c處(3.64 ppm)的峰對(duì)應(yīng)于AP上的特征性羥基質(zhì)子峰；d處(0.91 ppm)對(duì)應(yīng)于多肽PP上-CH3質(zhì)子峰，e處(4.26 ppm)是多肽PP形成的肽鍵中-NCHCO-特征性質(zhì)子峰。結(jié)果表明，AP-PP-DOX成功合成。

圖6AP-PP-DOX核磁氫譜圖

Fig.61H-NMR spectra of AP-PP-DOX

3.2粒徑、電位和TEM圖 見圖7～8。

由圖7可知，測(cè)定納米粒平均粒徑為139.00±3.32 nm(P.I.值為0.219)，平均電位為-28.45±0.22 mV。

由圖8可知，TEM觀察到納米粒呈圓形、結(jié)構(gòu)規(guī)整、分布均一，粒徑100 nm。

圖7AP-PP-DOX納米粒粒徑和電位

Fig.7 Particle size and potential of AP-PP-DOX nanoparticles

圖8AP-PP-DOX納米粒TEM圖

Fig.8 TEM image of AP-PP-DOX nanoparticles

3.3載藥量的測(cè)定 按照載藥量公式計(jì)算納米粒平均載藥量為17.00%±1.72%。

3.4MMP-2酶解釋藥實(shí)驗(yàn) 將納米粒和不同質(zhì)量濃度的MMP-2酶作用24 h后，測(cè)定該納米粒藥物釋放情況，結(jié)果見圖9。

圖9AP-PP-DOX納米粒體外累積釋藥曲線

A.+MMP-2(40 nmol·L-1)；b.+MMP-2(20 nmol·L-1)；c.+MMP-2(10 nmol·L-1)；d.+PBS(20 nmol·L-1)。

Fig.9Invitrocumulative drug release profile of AP-PP-DOX nanoparticles

A.+MMP-2(40 nmol·L-1)；b.+MMP-2(20 nmol·L-1)；c.+MMP-2(10 nmol·L-1)；d.+PBS(20 nmol·L-1).

圖10AP-PP-DOX對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性

Fig.10 Cytotoxicity of AP-PP-DOX in A549 cells

由圖9可知，釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組納米粒(AP-PP-DOX+PBS)24 h釋藥率僅為8.69%，而實(shí)驗(yàn)組納米粒[AP-PP-DOX+MMP-2(40 nmol·L-1)]24 h釋藥率高達(dá)74.5%，可見在MMP-2作用下納米粒釋藥率明顯增加；且整個(gè)釋藥曲線呈現(xiàn)先快后慢的趨勢(shì)，尤其是前4 h釋藥率高達(dá)60%左右，說明納米粒在MMP-2作用下能在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速釋藥。另外，AP-PP-DOX+MMP-2(40 nmol·L-1)納米粒相比于AP-PP-DOX+MMP-2(20 nmol·L-1)納米粒，24 h釋藥率僅增加3%左右，說明MMP-2酶在20 nmol·L-1時(shí)已達(dá)到“飽和濃度”，再增加酶濃度并不能顯著增加釋藥率。

3.5細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 不同質(zhì)量濃度的納米粒和A549細(xì)胞作用48 h后其細(xì)胞毒性測(cè)定，結(jié)果見圖10。

由圖10可知，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度分別為0.3和1 μg·mL-1時(shí)，AP-PP-DOX組細(xì)胞存活率顯著高于游離DOX組(P<0.05)；而當(dāng)藥物質(zhì)量濃度分別達(dá)3和9 μg·mL-1時(shí)，AP-PP-DOX組細(xì)胞存活率極顯著高于游離DOX組(P<0.01)，說明在相同藥物質(zhì)量濃度下該納米粒細(xì)胞毒性比游離DOX低。當(dāng)藥物質(zhì)量濃度分別為1和3 μg·mL-1時(shí)，AP-PP-DOX+MMP-2組細(xì)胞存活率顯著高于AP-PP-DOX組(P<0.05)；而當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)9 μg·mL-1時(shí)，AP-PP-DOX+MMP-2組細(xì)胞存活率極顯著高于AP-PP-DOX組(P<0.01)，說明在MMP-2作用下該納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率明顯增加。

4 討論

腫瘤微環(huán)境刺激響應(yīng)型納米遞藥體系，能夠根據(jù)腫瘤微環(huán)境中獨(dú)特的性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)藥物的智能性靶向釋放，成為近年來研究靶向藥物遞送系統(tǒng)的熱點(diǎn)方向[24]。其中酶敏型腫瘤靶向納米遞藥體系是指將抗腫瘤藥物和載體通過酶敏肽相連，在腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的各種酶類，如基質(zhì)金屬蛋白酶、組織蛋白酶和谷胱甘肽酶等作用下特異性裂解多肽鏈并靶向釋藥的體系[25]。

本文通過化學(xué)合成的手段將AP用MA經(jīng)多步驟反應(yīng)合成了AP-PP-DOX聚合物，并由此構(gòu)建了基于AP的酶敏腫瘤靶向納米遞藥體系。該體系相比于其他多糖利用物理包封方法或用人工材料PEG等構(gòu)建的納米遞藥體系，具有制備簡(jiǎn)單、載藥率高的優(yōu)點(diǎn)。例如劉占軍等[26]利用殼寡糖包載羥基喜樹堿(HCPT)制備納米粒的載藥率僅為3.62%±0.05%；Yu H等[27]利用PEG包載羥基喜樹堿(CPT)和Dai Z等[28]利用PEG包載紫杉醇(PTX)的載藥率分別僅有3.46%和4.6%。這是因?yàn)樽鳛榇蠓肿游镔|(zhì)的AP，不僅水溶性良好，且擁有大量活性基團(tuán)，可以化學(xué)鍵合大量的疏水性藥物DOX，形成兩親性聚合物，能很容易的通過透析法自主裝形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的納米粒。測(cè)定該納米粒粒徑為100 nm，能通過EPR效應(yīng)靶向到達(dá)腫瘤組織，并在基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)作用下裂解PP釋放DOX。上述體外模擬釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該納米粒能在MMP-2作用下成功釋藥。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，加入MMP-2酶組納米粒對(duì)A549細(xì)胞的抑制率明顯優(yōu)于未加酶組，進(jìn)一步證實(shí)了該納米粒在MMP-2酶的作用下能夠酶解釋藥，并發(fā)揮DOX抗腫瘤效果。此外，我們以AP作為藥物載體，不僅能很好的載藥，還能發(fā)揮其本身的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，有利于腫瘤的治療，這將通過后期免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)想將AP既作為納米遞藥體系的載體材料，又作為效應(yīng)分子發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，與化療藥物共同構(gòu)建酶敏腫瘤靶向納米遞藥體系，實(shí)現(xiàn)DOX靶向殺傷腫瘤細(xì)胞和AP改善腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的協(xié)同抗腫瘤作用，更有利于腫瘤的治療和機(jī)體的康復(fù)，為腫瘤的治療提供了新思路。

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