銀杏內酯N水溶性磺丁基-β-環糊精包合物的研究

陳 剛,何盛江

(1.中國人民解放軍第113醫院,寧波 315040；2.廣東省中藥研究所,廣州 510520)

磺丁基-β-環糊精(SBE-β-CD)是一種陰離子型、高水溶性的β-CD衍生物[1-3],能很好地與藥物分子包合形成非共價復合物,提高難溶性藥物的溶解度[4-5]、水溶性以及安全性,降低腎毒性,緩和藥物溶血性,在口服制劑、注射劑眼用制劑和經皮給藥制劑中已有較好的應用[6-7]。SBE-β-CD是β-CD與1,4-丁烷磺內酯發生取代的產物,由于立體位阻及反應條件的限制,取代度一般不超過10%。

銀杏內酯是銀杏葉中一類重要的活性成分,對血小板活化因子(PAF)受體具有特異性抑制作用[8-9],銀杏內酯N(ginkgolide N,GN)在銀杏內酯中生理活性最強,是較強的血小板活化因子拮抗劑[10],可用于治療血栓、急性胰腺炎和心血管疾病,還可用于轉移性癌癥的治療,對損傷神經元也有保護作用。但GN水溶性極差,限制了其應用。本課題以GN為模型藥物,制備GN的SBE-β-CD主客超分子包合物,對其制備工藝進行優化,并對其性質進行了表征與研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 R-210型旋轉蒸發儀(瑞士步琦有限公司);LGJ-18S冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司);Agilent 1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);AY120電子天平(日本島津公司)。

1.2試藥 GN原料藥,GN對照品(自制,批號20160811)；磺丁基-β-環糊精(上海笛柏生物科技有限公司,批號DT23,平均取代度7.0)；甲醇、乙腈為色譜純；實驗用水為高純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1GN/SBE-β-CD的相溶解度圖的繪制

2.1.1包合物樣品的制備 ①超聲法:精密配制質量濃度為0.05,0.1,0.2,0.3和0.5 g·mL-1的SBE-β-CD的系列水溶液,分別取各質量濃度的SBE-β-CD水溶液10 mL,加入過量的GN固體粉末50 mg,密塞,置于恒溫振蕩器中,分別在25,40和50 ℃下振蕩包合48 h[11]。②研磨法:取適量GN與SBE-β-CD(摩爾比1∶10),先將SBE-β-CD放入潔凈的研缽中用少量蒸餾水研勻后,緩慢加入藥物,在水浴40 ℃下研磨1.5 h,呈糊狀,將包合物25 ℃真空干燥2 h,研細,用適量無水乙醇洗滌未包合的GN,沉淀干燥,即得。③共沉淀法:稱取GN,加乙醇超聲使其完全溶解,慢速滴入40 ℃含SBE-β-CD 0.5 g·mL-1的水溶液中(摩爾比1∶10),攪拌30 min,室溫下磁力攪拌24 h,0.45 μm微孔濾膜過濾,將沉淀物于40 ℃真空干燥。

2.1.2相溶解度圖的繪制 以水為溶劑的不同質量濃度的SBE-β-CD試樣包合結束后,取上清液,用0.45 μm微孔濾膜過濾[12],超聲處理(600 W,40 kHz)15 min,用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續濾液,HPLC法測定,以SBE-β-CD質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(x)、GN質量濃度(μg·mL-1)為縱坐標(y),繪制包合物在25,40和50 ℃的相溶解度圖,結果見圖1。采用差示掃描量熱法(DSC)、X-射線衍射法(XRD)和紅外光譜法(IR)對制備的包合物進行鑒定。

圖1包合物在不同溫度的相溶解度曲線(n=3)

Fig.1 Phase solubility curves of the complex at different temperatures(n=3)

由圖1可知,在25,40和50 ℃時,GN的相溶解度圖均呈現出AL型特點,可以推斷SBE-β-CD與GN的包合過程是以物質的量比為1∶1進行的。從實驗結果可知,不同溫度下GN的相溶解度圖均呈現出AL型特點,GN質量濃度隨著SBE-β-CD質量濃度的增加而線性增加,可以推斷SBE-β-CD與GN的包合是按照物質的量的比為1∶1進行。GN/SBE-β-CD包合物體系由穩定常數計算公式得,50 ℃穩定常數Kc=0.204。在50 mmol·L-1的SBE-β-CD溶液中,GN的溶解度比在水中的溶解度增加了106倍。

另外,從不同溫度的相溶解度曲線圖可知,隨著溫度的升高，包合物的超分子包合常數減小,表明溫度的升高有利于超分子包合物形成。

2.1.3GN含量測定方法 色譜柱:EclipseSB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相:甲醇-四氫呋喃-水(25∶10∶65)；流速:1.0 mL·min-1；檢測波長:225 nm；柱溫:35 ℃；進樣體積：10 μL[13-17]。

GN在9.6 min處出峰,峰形良好,無雜質干擾,理論塔板數和分離度均符合測定要求。專屬性實驗表明,其他輔料不干擾GN的測定。見圖2。

圖2HPLC圖

A.GN對照品；B.輔料空白。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.GN reference；B.auxiliary ingredient blank.

2.1.4標準曲線的建立 精密稱定GN對照品250 mg,置于25 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為母液。加甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成質量濃度分別為1,2,4,5和10 mg·mL-1。精密移取上述質量濃度溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。用質量濃度x對峰面積y進行線性回歸,得回歸方程為y=256.4x-11.83,r=0.999,結果表明，GN質量濃度在1～10 mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.1.5包合物包合率的測定 精密稱取GN/SBE-β-CD包合物10 mg,置于100 mL量瓶中,加入甲醇20 mL充分溶解,用水定容至刻度。用0.45 μm的微孔濾膜過濾,用HPLC法測定質量濃度,計算GN含量,并按照下式計算包合率：包合率(%)=(包合物含藥量/投藥量)×100%。結果顯示,制備工藝不同,包合物產率也不同,研磨法、超聲法和共沉淀法3種方法所得的包合率分別為60.1%,72.4%和81.5%。

2.1.6包合物穩定常數的測定 分別對不同溫度的各條相溶解度曲線的直線部分作線性回歸,計算回歸方程的斜率(b)和截距(a),根據公式Kc=b/[a×(1-b)],計算不同溫度的GN/SBE-β-CD包合物穩定常數,結果見表1。

表1不同溫度GN/SBE-β-CD包合物的穩定常數

Tab.1 The stability constant of GN/SBE-β-CD complex at different temperatures

溫度/℃線性方程r包合物穩定常數25y=0.008x+0.0730.99850.11040y=0.016x+0.1050.99850.15550y=0.022x+0.1100.99650.204

由表1可知,GN與SBE-β-CD形成的包合物隨著溫度的升高,包合物的穩定常數增加,表明溫度升高有利于包合物形成。β-CD分子空穴內徑7～8 ?,空穴深度7～8 ?,GN分子大小在4～7 ?之間,疏水性結構可進入空穴內被SBE-β-CD包裹,因此能夠提高GN在水中的溶解度。

2.2包合物的鑒定

2.2.1差示掃描量熱分析(DSC) 以空鋁坩堝為參比物,另一鋁鍋放入10 mg樣品,升溫速率為10 ℃·min-1,掃描范圍為20～300 ℃,測定氣體為N240～60 mL·min-1,分別對GN、SBE-β-CD、物理混合物和GN/SBE-β-CD包合物進行DSC測定。

在DSC圖譜中,藥物在245.8 ℃出現1個尖銳的吸熱峰,此峰為藥物的溶解峰。SBE-β-CD的DSC曲線表明,SBE-β-CD為無定形粉末。在物理混合物的DSC圖譜中,藥物的吸熱峰明顯降低；在包合物的DSC圖譜中,藥物在245 ℃左右的吸收峰幾乎完全消失,藥物的圖譜有明顯的差異,說明SBE-β-CD已完全包合GN,見圖3。

圖3差示掃描量熱圖譜

A.GN；B.SBE-β-CD；C.物理混合物；D.GN/SBE-β-CD包合物。

Fig.3 Differential scanning calorimetry

A.GN；B.SBE-β-CD；C.physical mixture；D.GN/SBE-β-CD complex.

2.2.2X射線粉末衍射(XRD) 測試條件為Cu靶；管電壓:40 kV；管電流:30 mA；掃描范圍:5～40 °；掃描速度:2 °·min-1。取GN、SBE-β-CD、兩者的物理混合物和GN/SBE-β-CD包合物,按照上述條件進行測試。

粉末X-射線衍射圖譜,見圖4。由圖4可知,藥物呈現許多尖銳的晶體衍射峰,而SBE-β-CD的衍射峰較寬且弱,無明顯尖銳峰,表明SBE-β-CD可能為無定形。二者物理混合物仍有藥物衍射峰和弱峰存在,表現為GN和SBE-β-CD二者衍射峰的疊加。而在包合物的衍射圖譜中沒有出現藥物的晶體衍射峰,僅有幾個GN的特征峰但強度大大降低,表明形成了一種新的物相,藥物在包合物中以無定形狀態存在。

圖4粉末X射線衍射圖譜

A.GN；B.SBE-β-CD；C.物理混合物；D.GN/SBE-β-CD包合物。

Fig.4 Powder X ray diffraction spectra

A.GN；B.SBE-β-CD；C.physical mixture；D.GN/SBE-β-CD complex.

2.2.3紅外光譜分析(IR) Bruker Tensor 27紅外光譜儀,KBr壓片法制備樣品,掃描范圍為400～4 000 cm-1,將GN、SBE-β-CD、兩者的物理混合物和GN/SBE-β-CD包合物分別進行紅外掃描。

GN在1 000～1 500及2 968 cm-1附近的特征吸收峰,在物理混合物中也有體現,而在包合物圖譜中沒有出現,表明藥物分子中含有的羰基與SBE-β-CD中的羥基形成了氫鍵。在3 235 cm-1附近較寬的吸收峰為SBE-β-CD中締合羥基的特征峰,在包合物的圖譜中此處峰形明顯變寬,說明SBE-β-CD上的羥基的存在狀態有一定的改變。以上分析表明,藥物進入SBE-β-CD的空腔而被包合,而不僅僅是物理混合,見圖5。

圖5紅外光譜圖譜

A.GN；B.SBE-β-CD；C.物理混合物；D.GN/SBE-β-CD包合物。

Fig.5 Infrared spectra

A.GN；B.SBE-β-CD；C.physical mixture；D.GN/SBE-β-CD complex.

3 討論

采用溶液攪拌法制備了GN/SBE-β-CD包合物,通過DSC、XRD和IR對包合物進行了鑒定,結果表明，GN被SBE-β-CD包合后呈現了新的物相特征,并提高了GN的溶解度。水溶性SBE-β-CD與GN之間形成包合物的機制,水溶性SBE-β-CD提高GN生物利用度的作用有待于進一步的研究[18-19]。

因環糊精空腔是疏水的,客體分子的非極性越高,越易被包合。SBE-β-CD本身帶有負電荷,因此它對中性和帶正電荷的藥物包合作用好,形成的包合物溶解度大。

包合介質應選擇強親水性的溶劑,防止溶劑與SBE-β-CD形成穩定的包合物,對藥物與SBE-β-CD的包合造成競爭性抑制。包合過程中對不同的藥物,選擇合適的溫度、pH值等反應條件也能改善包合效果。參考文獻：

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