不同菌株培養順序對添加黏土礦物白漿土腐殖質組成的影響

王 帥, 徐俊平, 王 楠, 竇 森, 劉 蘭, 范嘉妍, 李芳慧

(1. 吉林農業科技學院 農學院, 吉林 吉林 132101； 2. 吉林農業大學 資源與環境學院, 長春 130118)

木質素等有機分子的腐殖化是土壤自然肥力形成的物質基礎, 農業固體廢棄物中含有大量的木質纖維成分, 由于木質素的纏繞保護作用, 使得纖維成分不易降解, 因此, 加速木質素向腐殖質(HS)轉化已成為促進堆肥快速腐解的關鍵[1]. 在土壤腐殖化進程中, 木質素及其酚型、 醌型和脂肪族化合物等降解產物均可成為HS形成的重要前體物質[2]. 木質素完全降解是真菌、 細菌及其微生物群落共同作用的結果, 由于木質素分解是一個氧化過程[3], 因此真菌驅動的氧化反應在次生代謝階段占主導地位； 細菌降解木質素在初級代謝階段主要對其結構進行改性, 使其增加水溶性， 并產生一種被修飾的、 水溶的、 酸可沉淀的多聚木質素. 多聚木質素中的酚羥基、 羧基與HS含氧官能團結構相似, 可作為HS形成的前體物質[4].

在原始土壤形成過程中, 礦物質參與HS的合成反應, 既充當微生物生存所附著的黏附界面, 又可充當氧化劑成為胞外呼吸的電子受體[5], 對木質素分解及HS形成起非生物催化作用. 此外, 礦物也可加速酚類化合物的非生物聚合作用[6]. 目前關于微生物利用木質素形成HS以及微生物不同接種順序對HS的影響研究較多: 李艷等[7]研究表明, 微生物能促進混有玉米秸稈暗棕壤的腐殖化程度, 其中細菌作用最小； Huang等[8]將黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)和栗褐鏈霉菌(Streptomycesbadius)接種于稻草秸桿, 研究了其對稻草秸稈的生物脫木質化作用; Yanagi等[9]通過接種金色鏈霉菌(Streptomycesaureus)、 鮭貝革蓋菌(CoriolusconsorsImaz)、 毛云芝菌(Coriolushirsutus)和樺革褶菌(Lenzitesbetulina)等研究了各菌株對5種來源胡敏酸(HA)脫色降解的差異, 揭示了HA化學結構以及對微生物脫色反應的抵制特性與微生物種類有關； Xi等[10]利用多階段接種微生物菌劑的方法明顯提高生活廢棄物堆肥腐熟階段的細菌群落多樣性, 進而加快堆肥的腐熟進程; Filip等[11]研究表明, 黏土礦物能縮短暗色物質的形成時間, 對堿提取腐殖酸類聚合物的形成有促進作用； Fukuchi等[12]研究表明, 沸石有利于類HA中氮含量和分子量的提高, 對醌、 酮等羰基碳含量有促進作用； Duarte等[13]研究表明, 礦物表面明顯抑制土壤HA分子中非晶形亞甲基結構的形成, 但可促進HA的芳香度. 對微生物驅動下木質素向HS轉化以及礦物參與腐殖化進程的研究較多， 但不同菌株培養順序以及不同黏土礦物添加對HS組成的差異影響尚未見文獻報道.

K礦物和M礦物均為土壤中常見的、 數量較大的、 1∶1型和2∶1型層狀硅酸鹽黏土礦物的典型代表, 二者在比表面積、 層間作用力、 膨脹性和可塑性等物理性狀上存在差異[14], 通過靜電引力和疏水作用力對土壤微生物學特性產生差異影響, 進而在微生物利用底物、 硝化與呼吸作用以及生長繁衍等方面有促進或抑制作用, 最終影響微生物驅動下木質素向HS的轉化進程[15]. 本文在室內培養條件下, 以混有木質素的白漿土為供試對象, 通過設置黑曲霉(Aspergillusniger)、 巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)的6種培養順序, 以SiO2為對照, 研究K礦物和M礦物對白漿土腐殖質組成的差異影響, 并分析黏土礦物參與腐殖質形成機理以及不同菌株培養順序對腐殖質組成的影響規律.

1 材料與方法

1.1 材 料

白漿土取自吉林農業科技學院北大地玉米實驗田(E 126°28′48.66″, N 43°57′34.85″), 經風干、 粉碎后過0.25 mm篩； 木質素購于日本東京化成工業株式會社, CAS No.[9005-53-2]； 高嶺土(石)(Al2O3·2SiO2·2H2O, CAS No.[1332-58-7])和蒙脫土(石)(K10, CAS No.[1318-93-0])購于國藥集團化學試劑有限公司； SiO2購于天津科密歐化學試劑有限公司.

1.2 實 驗

采用室內培養法. 準確稱取18.5 g白漿土于100 mL三角瓶中, 添加0.5 g木質素與1.0 g礦物質粉末, 混勻后用蒸餾水將混料含水量調至田間持水量的80%, 塞緊防菌棉塞, 用報紙包扎后進行高壓蒸汽滅菌(121 ℃, 20 min), 待滅菌徹底后, 在無菌條件下自然冷卻.

供試礦物為高嶺土(石)(kaolinite, K)和蒙脫土(石)(montmorillonite, M), 以SiO2(silicon dioxide, Sd)為對照. 3種菌株均從白漿土中篩選, 經16sRNA鑒定, 分別歸屬于細菌類芽孢菌屬中的巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、 放線菌類鏈霉菌屬中的灰色鏈霉菌(S.griseus)及真菌類曲霉屬中的黑曲霉(A.niger). 將B.megaterium用牛肉膏-蛋白胨培養基擴培,S.griseus用高氏一號培養基擴培,A.niger用馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基擴培. 3種菌株懸液的制備方法如下： 用少量無菌生理鹽水清洗已擴培的單一菌株(或孢子), 倒入裝有無菌生理鹽水的錐形瓶中, 28 ℃搖瓶培養30 min制成單一菌株懸液. 用稀釋平板法計算B.megaterium和S.griseus的菌落數分別為5.9×106,6.0×109個/mL, 用血球計數板計數A.niger的孢子數量為68 個/mL. 將3種單一菌株懸液按不同排列組合及Ⅰ期培養菌株→Ⅱ期培養菌株→Ⅲ期培養菌株方式可產生6種培養順序, 即A.niger→B.megaterium→S.griseus(ABS);A.niger→S.griseus→B.megaterium(ASB);B.megaterium→S.griseus→A.niger(BSA);B.megaterium→A.niger→S.griseus(BAS);S.griseus→B.megaterium→A.niger(SBA);S.griseus→A.niger→B.megaterium(SAB). 基于每種礦物的菌株培養順序均重復3次.

在無菌操作條件下, 先向滅菌后的培養料中接種單一菌株懸液(Ⅰ), 塞緊防菌棉塞， 用報紙包扎, 置于28 ℃恒溫培養箱中培養15 d后, 取出樣品接種菌株懸液(Ⅱ), 重復上述過程, 再接種菌株懸液(Ⅲ)， 培養15 d后, 在28 ℃恒溫培養箱中繼續培養65 d, 共培養110 d. 菌懸液接種量以每100 mL錐形瓶中注入5 mL進行, 待110 d培養結束后取樣, 迅速轉入鼓風干燥箱(45 ℃, 48 h)中終止微生物活動, 研磨土樣并過0.01 mm篩, 將樣品保存于玻璃干燥器中, 用于腐殖質組成分析.

1.3 測試方法

采用腐殖質組成修改法對動態收集、 培養后的土樣進行分析, 過程如下： 稱取過0.01 mm篩的土樣5.00 g于100 mL塑料離心管中, 添加30 mL蒸餾水, 攪拌均勻后在恒溫水浴振蕩器中于70 ℃提取1 h, 在3 500 r/min離心15 min, 將上清液過濾至50 mL容量瓶中, 在帶有殘渣的離心管中加水20 mL, 攪拌均勻, 再離心, 合并上清液, 用蒸餾水定容, 該溶液即為水溶性物質(water soluble substance, WSS). 將蒸餾水換為0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L Na2P2O7混合液對殘渣進行提取, 將收集的溶液定容至50 mL后即為可提取腐殖酸(humic-extracted acid, HE). 離心管中殘渣經蒸餾水洗滌至洗液接近中性, 將其轉入鼓風干燥箱于55 ℃烘干至恒質量, 該沉淀即為胡敏素(humin, Hu).

取上述HE溶液30 mL, 用0.5 mol/L的H2SO4調至pH=1.3后, 置于70 ℃水浴鍋中保溫1.5 h, 靜置過夜, 過濾溶液， 定容至50 mL容量瓶中, 該溶液即為富里酸(fulvic acid, FA). 濾紙上的殘渣先用0.05 mol/L H2SO4洗滌, 再用0.05 mol/L溫熱的NaOH將其溶解于50 mL容量瓶中, 定容, 該溶液即為胡敏酸(humic acid, HA)的堿溶液, 腐殖質各組分有機碳質量比分別用wC(WSS),wC(FA),wC(HA)和wC(Hu)表示, 采用K2Cr2O7氧化法測定, 用北京普析通用儀器有限責任公司生產的TU-1901型紫外可見分光光度計測定HA堿溶液在400,600 nm處的吸光值(E400和E600), 并計算其色調系數ΔlogK=logE400-logE600.

1.4 數據處理方法

采用EXCEL 2003和SPSS 18.0(PASW Statistics 18)軟件對數據進行整理并分析差異顯著性.

2 結果與討論

2.1 菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土wC(HA)/wC(FA)的影響

a,b,c表示添加不同礦物、 相同菌株培養順序在p<0.05水平上的差異顯著性； A,B,C,D,E表示添加相同礦物、 不同菌株培養順序在p<0.05水平上的差異顯著性.圖1 菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土wC(HA)/wC(FA)的影響Fig.1 Effects of microbial culture sequences on wC(HA)/wC(FA) extracted from albic soils amended with different minerals

HA是帶有負電荷的膠體物質, 呈微酸性, 溶于堿, 是土壤HS中最活躍的組分, 對土壤肥力形成及表達較重要; FA是一類分子量小、 生理活性大、 氧化程度較高、 既溶于酸又溶于堿的HS組分, 對HA的積累和更新起關鍵作用, 并可促進礦物分解和養分釋放[16]. 胡富比wC(HA)/wC(FA)用于表征C(HA)與C(FA)間的相互轉化關系, 該比值越大, 腐殖質品質越好. 圖1為菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土wC(HA)/wC(FA)的影響. 由圖1可見： 基于ABS,ASB和BAS的培養順序, K礦物添加使混有木質素白漿土的wC(HA)/wC(FA)顯著高于M礦物; 在SBA和SAB的影響下, K礦物添加使白漿土的wC(HA)/wC(FA)顯著低于M礦物； 在BSA的影響下, K和M礦物添加白漿土的wC(HA)/wC(FA)差異不顯著, 但均顯著高于Sd處理. 當以A.niger為Ⅰ期培養菌株, 或以B.megaterium為Ⅰ期培養菌株、A.niger為Ⅱ期培養菌株時, K礦物對混有木質素白漿土wC(HA)/wC(FA)的促進作用大于M礦物, 從而提升腐殖質品質. 這是由于K礦物有利于促進土壤中細菌和放線菌的數量[17]所致. 當真菌A.niger在初期培養后, K礦物并未促進其數量增長, 使得A.niger在消耗完較易利用的碳源后, 自身活性減弱而以菌體的形式進入土壤, 礦化作用被極大削弱, 之后接種的細菌和放線菌得到K礦物的促進使其數量擴增, 但因碳源的耗竭而使菌株不易獲取能量, 此時真菌A.niger的死亡菌體歷經縮合, 使FA向HA轉化. 當以B.megaterium為Ⅰ期培養菌株時, 其數量得到擴增, 僅消耗了部分碳源, 接種的真菌因有部分碳源可利用, 因此發揮了部分降解作用, 為之后縮合提供了較多的菌體物質, 從而提升了腐殖酸中HA的比例, 使wC(HA)/wC(FA)增加. 當以S.griseus為Ⅰ期培養菌株時, M礦物比K礦物更利于增加白漿土的wC(HA)/wC(FA), M礦物層間距較大,S.griseus易進入層間而被固定, 使其活性降低, 菌體嵌入更易形成穩定的有機碳成分, M礦物因具有較好的親和性, 通過配體交換使更多HA吸持在M礦物表面[18], 通過吸附80%以上的微生物可改變其代謝活性, 進而影響微生物驅動下的腐殖化進程[19], 最終使白漿土的wC(HA)/wC(FA)獲得較大提升. 在B.megaterium→S.griseus→A.niger的培養順序下, 其菌體未經縮合, 因此添加K礦物或M礦物對混有木質素白漿土wC(HA)/wC(FA)差異的影響均較小, 但仍高于對照處理. 因此, 與SiO2相比, K礦物和M礦物具有促進縮合、 使HA所占比例增加的作用. 在添加K礦物和M礦物后, 不同菌株培養順序下白漿土的wC(HA)/wC(FA)規律分別為： ASB≈BAS>ABS>BSA>SBA>SAB和SBA≈SAB>ABS≈BSA>BAS>ASB.可見, 在混有木質素白漿土中添加K礦物,A.niger或B.megaterium為Ⅰ期培養菌株更利于增加白漿土的wC(HA)/wC(FA)； 當添加礦物為M礦物時, Ⅰ期培養菌株為S.griseus更利于C(FA)向C(HA)轉化.

2.2 菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土HA的Δlog K影響

HA色調系數(ΔlogK)是考察HA分子結構的定性指標, 其值越高, HA數均分子量越小, 分子結構越簡單[20]. 圖2為菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土HA的ΔlogK影響. 由圖2可見: 基于ABS,ASB,SBA和SAB處理條件, 向混有木質素白漿土中添加K礦物可使HA的ΔlogK顯著低于添加M礦物的值(KM; 基于BSA處理條件, 添加K和M礦物均未對HA的ΔlogK產生顯著影響, 但二者的ΔlogK均顯著高于Sd的處理結果. 可見, 當以A.niger或S.griseus為Ⅰ期培養菌株時, 與M礦物相比, K礦物更易使混有木質素白漿土HA的分子結構趨于復雜. 相對于B.megaterium,A.niger和S.griseus在降解木質素的次生和初級代謝階段更有優勢, 因此添加礦物為M礦物時, M礦物的較大層間距、 比表面積和黏附性可為微生物提供更多活動場所[21], 使其礦化分解作用占優勢[22], 而K礦物層間距小, 僅通過表面吸附增加微生物與木質素的接觸幾率, 促進腐殖化進程, 使白漿土HA分子結構更復雜. 在以B.megaterium為Ⅰ期培養菌株時有兩種情況： 1) 當以A.niger作為Ⅱ期培養菌株時, M礦物更易促進白漿土HA分子結構的復雜化,B.megaterium的初期培養可使木質素發生改性, 添加M礦物可使其數量增加, 進而增強其對木質素的改性, 之后接種的A.niger被礦物固定并發揮較大程度降解[23], 最終由S.griseus對菌體進行縮合, 使HA分子結構更復雜； 2) 當以S.griseus為Ⅱ期培養菌株時, K礦物和M礦物對白漿土HA分子結構的影響差異不顯著, 但與SiO2相比, K礦物和M礦物均有利于微生物降解HA, 使其分子結構相對簡單.B.megaterium在Ⅰ期培養階段可使木質素發生改性,S.griseus的降解能力較A.niger弱, 且A.niger菌體不與其他菌株縮合, 因此兩種礦物間無差異.

2.3 菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土wC(Hu)的影響

Hu是與礦物質緊密結合的HS, 是土壤中的惰性物質, 對于土壤結構穩定、 養分保持、 碳截獲以及生物地球化學循環等均具有重要意義[16]. 圖3為菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土wC(Hu)的影響.

a,b,c表示添加不同礦物、 相同菌株培養順序在p<0.05水平上的差異顯著性； A,B,C,D表示添加相同礦物、不同菌株培養順序在p<0.05水平上的差異顯著性.圖2 菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土HA的Δlog K影響Fig.2 Effects of microbial culture sequences on Δlog K value of HA extracted from albic soils amended with different minerals

a.b.c表示添加不同礦物、 相同菌株培養順序在p<0.05水平上的差異顯著性； A,B,C,D表示添加相同礦物、不同菌株培養順序在p<0.05水平上的差異顯著性.圖3 菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土wC(Hu)的影響Fig.3 Effects of microbial culture sequences on wC(Hu) extracted from albic soils amended with different minerals

由圖3可見, 在添加K礦物條件下, 與Sd相比, 除SBA處理能使白漿土wC(Hu)與對照持平外, 其他5種菌株培養順序均有利于wC(Hu)的累積, 其中SAB的優勢最大, 使wC(Hu)增加119.1%. 當K礦物參與微生物對木質素降解時, 除S.griseus→B.megaterium→A.niger外, 其他菌株培養順序均有利于木質素降解成分與K礦物的結合, 形成更多的Hu組分. 當M礦物參與微生物對木質素降解時, 與Sd相比, 除ASB處理可顯著增加wC(Hu)外, ABS,BAS和SAB的培養順序均未對wC(Hu)產生顯著影響, BSA和SBA處理使wC(Hu)分別降低38.9%和50.0%. 當以A.niger為Ⅲ期培養菌株時,B.megaterium與S.griseus的培養順序不影響對白漿土C(Hu)的礦化分解, 這是因為S.griseus和B.megaterium在培養Ⅰ、 Ⅱ期已對木質素進行改性, 失活的菌體又會給A.niger的降解作用提供能源, 因此可增加A.niger對C(Hu)的礦化作用.

2.4 不同菌株培養順序對混有木質素白漿土TOC,wC(WSS),wC(HE)的影響

表1列出了在不同礦物添加條件下, 菌株培養順序對混有木質素白漿土TOC,wC(WSS)和wC(HE)的影響. 由表1可見: 基于BAS和SAB的培養順序, 添加M礦物使混有木質素白漿土TOC的礦化程度大于K礦物, 在其他4種培養順序下, K與M礦物對TOC的影響差異不顯著; 當添加礦物為K或M時, SAB的培養順序均使TOC積累量在供試6種菌株培養順序中最大; 在BAS和SAB兩種培養順序下, M礦物對Ⅱ期培養菌株為A.niger的白漿土TOC的礦化有較好促進作用, 即通過提供微生物活動場所， 擴增其數量, 進而增強白漿土TOC的礦化； 在其他4種菌株培養順序下, 添加K和M礦物并未對礦化作用產生差異影響；S.griseus→A.niger→B.megaterium對白漿土TOC的礦化能力最弱.

表1 菌株培養順序對添加不同礦物中混有木質素白漿土TOC,wC(WSS)，wC(HE)的影響*

*a,b,c表示相同菌株培養順序、 不同礦物在p<0.05水平上的差異顯著性； A,B,C,D表示相同礦物、 不同菌株培養順序在p<0.05水平上的差異顯著性.

基于ASB,BSA,BAS和SBA的培養順序, 添加K礦物使得白漿土的wC(WSS)顯著高于M礦物, 在SAB影響下, 結果相反, 在ABS影響下, 兩種礦物之間差異不顯著. 在S.griseus→A.niger→B.megaterium培養順序下, K礦物比M礦物更易促進微生物對白漿土C(WSS)的消耗, 在A.niger→B.megaterium→S.griseus影響下, 添加K礦物和M礦物未對C(WSS)產生差異影響, 在其他4種培養順序下, M礦物更易促進微生物對白漿土C(WSS)的消耗. 黏土礦物與可溶性有機物作用將改變礦物表面特性和反應活性[18], M礦物可優先吸附天然有機質的小分子部分[24], 使C(WSS)及微生物在M礦物顆粒表面接觸的幾率增加, 增大微生物對C(WSS)的消耗. 此外, 與對照相比, 添加M和K礦物均可使ABS和SBA兩種培養順序下白漿土的C(WSS)增多, ASB和BSA的培養順序更有利于微生物對C(WSS)的消耗. 在K礦物影響下, ASB在6種菌株培養順序中對白漿土C(WSS)的促進作用最大(9.7 g/kg), 在M礦物影響下, ABS更利于白漿土C(WSS)的積蓄.

在ABS和BAS培養順序下, K礦物可使白漿土的wC(HE)高于M礦物, 在ASB影響下, 結果相反, 在其他3種培養順序下, K與M礦物之間差異不顯著. 與對照相比, 在6種培養順序下, 添加K和M礦物均有利于混有木質素白漿土C(HE)的消耗. 由于C(HE)的兩個組分C(FA)和C(HA)無法全部進入M礦物土層間[25], 因此被微生物降解. 在A.niger→S.griseus→B.megaterium影響下, 培養前期缺乏B.megaterium對木質素的改性,A.niger的降解作用受限, 由于M礦物層間吸納了接種的S.griseus和B.megaterium, 因此更利于C(HE)的合成. 在6種菌株培養順序下, 與SiO2相比, 添加K和M礦物均有利于微生物對混有木質素白漿土C(HE)的消耗. 木質素的分解產物(脂類、 酚類和醌類化合物)可與氨基酸等物質發生聚合而形成HS, 在聚合期間, K和M礦物表面吸附的鐵、 鋁氧化物可促進木質素的氧化降解, 因此, 比SiO2更易促進C(HE)的分解消耗.

3 結 論

1) 當以A.niger為Ⅰ期培養菌株, 或以B.megaterium為Ⅰ期培養菌株、A.niger為Ⅱ期培養菌株時, K礦物對混有木質素白漿土wC(HA)/wC(FA)的促進作用大于M礦物, M礦物更利于HA分子結構的復雜化; 當以S.griseus為Ⅰ期培養菌株時, M礦物比K礦物更利于增加白漿土的wC(HA)/wC(FA). 在B.megaterium→S.griseus→A.niger培養順序下, 與SiO2相比, 兩類礦物均有利于wC(HA)/wC(FA)的增加, 使HA分子結構趨于簡單, 但兩類礦物間差異不顯著.

2) 除S.griseus→B.megaterium→A.niger外, 在其他5種接種順序下, K礦物更利于木質素降解成分與其結合, 形成更大數量的C(Hu).

3) 與K礦物相比, M礦物對Ⅱ期培養菌株為A.niger的白漿土TOC的礦化有較好促進作用.S.griseus→A.niger→B.megaterium培養順序對白漿土TOC的礦化能力最弱, 且K礦物比M礦物更易促進微生物對白漿土C(WSS)的消耗. 在A.niger→B.megaterium→S.griseus培養順序下, K礦物和M礦物未對C(WSS)產生差異影響, 在其他4種培養順序下, M礦物比K礦物更易促進微生物對白漿土C(WSS)的消耗.

4) 基于A.niger→B.megaterium→S.griseus和B.megaterium→A.niger→S.griseus培養順序, K礦物比M礦物更易促進C(HE)的形成. 在6種菌株培養順序下, 與SiO2相比, 添加K礦物和M礦物均有利于微生物對混有木質素白漿土C(HE)的消耗.

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