原發性膽汁性肝硬化患者肝組織轉化生長因子β-1表達水平變化

秦維，陳宇萍，楊昭，祝素平，霍玉玲，李木松

原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一種慢性進行性自身免疫性肝病。隨著疾病進展可引起肝細胞受損、肝纖維化，甚至肝硬化和肝衰竭。流行病學調查顯示，PBC年發病率為0.33/10萬～5.8/10萬，中老年女性為疾病高發人群[1，2]。PBC的發病機制較為復雜，涉及自身抗體的產生、分子細胞免疫學、環境因素、遺傳因素等多個方面。轉錄生長因子 -β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）具有廣泛的生物活性，可參與早期胚胎發育、間質纖維化、炎癥、免疫機制、腫瘤形成和發展等。既往研究指出，TGF-β1可參與多種慢性肝病的纖維化過程[3]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素 6（interleukin-6，IL-6）作為重要的炎性因子，可加重肝內炎癥反應，促使各類肝臟細胞增殖，在慢性肝臟病肝纖維化形成過程中起重要作用[4]。本研究分析了PBC患者肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6水平變化情況，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年1月～2017年1月我院住院的PBC患者52例，男性11例，女性41例；年齡31～77歲，平均年齡（53.2±4.2）年。診斷符合《原發性膽汁性肝硬化診斷和治療共識（2015年）》標準[5]，參照改良的Child-Pugh肝功能分級標準：A級15例，B級25例，C級12例。排除合并酒精性肝炎、藥物性肝損傷、病毒性肝炎等疾病，排除肝內外膽管梗阻性疾病和惡性腫瘤。另選擇健康體檢者20例，男性5例，女性15例；年齡28～75歲，平均年齡（52.1±5.6）歲。兩組人群性別和年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過，受試者簽署知情同意書。

1.2 肝活檢 常規在超聲引導下行肝穿刺活檢術，采集肝組織標本，長約1～1.5 cm。另自病理科保留的外科手術后獲得的正常肝組織20例。將獲得的肝組織用10%福爾馬林溶液固定過夜，石蠟包埋，常規切片，厚度為4 μm。行肝組織病理學檢查。S0期為無肝纖維化；S1期為匯管區擴大伴纖維組織增生；S2期為匯管區周圍纖維化或纖維間隔形成，小葉結構保留；S3期為肝纖維化伴小葉結構紊亂；S4期為重度肝纖維化或早期肝硬化。本組患者S0期7例，S1期12例，S2期18例，S3期9例，S4期6例。

1.3 肝組織TGF-β1表達檢測[6]取肝組織，經脫蠟、水化處理，去離子水洗滌5 min，用PBS洗滌5 min，采用高壓抗原修復法修復抗原，去離子水洗滌5 min，PBS洗滌5 min。在組織表面滴加3%過氧化氫，室溫下孵育20 min，PBS洗滌5 min，洗滌3次。在組織表面滴加胎牛血清，室溫下避光孵育20 min。抗TGF-β1和二抗均購自北京中山生物技術有限公司，常規染色，滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidin，DAB）顯色、封片，在光學顯微鏡下觀察。應用JVCKY-F30B 3-CCD攝像頭采集肝組織圖像并進行圖像分析，每張切片隨機選取10個視野，測量每一個視野中蛋白表達量，取其平均值。

1.4 血清TNF-α和IL-6水平檢測 空腹采集靜脈血3～5 mL，采用ELISA法檢測血清TNF-α和IL-6水平（上海恒斐生物科技有限公司）。

1.5 統計學處理 應用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計數資料采用x2檢驗；計量資料以±s表示，采用獨立樣本的t檢驗，多組比較采用F檢驗；P＜0.05提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肝組織TGF-β1表達情況 正常肝組織基本不表達或僅有少量的TGF-β1表達（圖1-1），而PBC患者肝組織實質細胞胞漿內呈高表達（圖1）。

圖1 肝組織TGF-β1表達情況（SP，400×） ①正常肝組織無TGF-β1表達；②PBC患者肝組織呈黃色顆粒高表達

2.2 兩組血清TNF-α和IL-6水平比較 PBC患者血清TNF-α和IL-6水平明顯高于健康人，差異有統計學意義（P＜0.01，表1）。

表1 兩組血清TNF-α和IL-6水平（±s）比較

表1 兩組血清TNF-α和IL-6水平（±s）比較

與健康人比，①P＜0.05

例數 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml）PBC 52 28.7±13.5① 21.3±9.4①健康人 20 5.6±2.7 2.1±1.6

2.3 不同肝纖維化分期PBC患者肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6水平比較 S0期肝纖維化患者肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6水平明顯低于其他各期患者，而S1、S2、S3和S4期患者之間上述指標比較差異也有統計學意義（P＜0.01，表2）。

表2 不同肝纖維化分期PBC患者肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6水平（±s）比較

表2 不同肝纖維化分期PBC患者肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6水平（±s）比較

與 S0期比，①P＜0.05；與 S1期比，②P＜0.05；與 S2期比，③P＜0.05；與 S3 期比，④P＜0.05

血清IL-6（pg/ml）S0 7 0.5±0.2 7.1±4.1 5.1±1.0 S1 12 4.2±1.3① 18.6±6.2① 11.5±3.6①S2 18 6.9±1.2①② 27.3±9.9①② 19.4±4.1①②S3 9 13.3±15.1①②③ 39.7±15.1①②③ 27.3±8.1①②③S4 6 21.2±17.1①②③④ 53.4±17.3①②③④ 47.8±11.0①②③④例數肝組織TGF-β1（10-2）血清TNF-α（pg/ml）

2.4 不同Child-Pugh分級肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6水平比較 Child-Pugh A級患者肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6水平明顯低于Child-Pugh B級和C級，Child-Pugh C級患者也低于Child-Pugh B級患者（P＜0.01，表3）。

表3 不同Child-Pugh分級肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α 和 IL-6 水平（±s）比較

表3 不同Child-Pugh分級肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α 和 IL-6 水平（±s）比較

與A級比，①P＜0.05；與B級比，②P＜0.05

血清IL-6（pg/ml）A級 15 1.9±1.6 12.2±3.1 7.3±2.5 B級 25 15.9±13.6① 32.9±8.6① 21.8±6.3①C級 12 22.6±18.5①② 49.1±19.3①② 45.5±12.7①②例數TGF-β1（10-2）血清TNF-α（pg/ml）

3 討論

TGF-β1作為一種調節細胞生長和分化的多肽，可參與肝纖維化的發生、發展。總結既往文獻，發現TGF-β1可能從以下幾個方面參與肝纖維化的形成：TGF-β1被認為是目前最強的促纖維化細胞因子之一，肝組織在各種病因的病理刺激下，可促使肝細胞及遷移的炎性細胞活化，釋放包括TGF-β1在內的細胞因子和可溶性因子，促使肝纖維化形成；抑制肝細胞增殖，促使肝星狀細胞活化，促進細胞外基質產生及沉積；TGF-β1/Smsd信號傳導通路調節細胞外基質基因表達，導致細胞外基質生成；下調基質金屬蛋白酶，上調金屬蛋白酶組織抑制因子，降低ECM的降解，加重肝纖維化，其余機制還有待進一步研究[8，9]。曾波等[10]研究報道，肝硬化患者血清TGF-β1水平明顯高于慢性乙型肝炎患者，且與肝纖維化程度呈正相關關系，認為TGF-β1參與了肝纖維化的發生。國外學者Wermuth et al[11]指出，TGF-β1異常升高是肝纖維化重要的病理特征之一。本研究發現，與正常健康人比較，PBC患者肝組織TGF-β1表達水平升高，這一研究結果與有關研究[12]報道相同。

大量實驗研究結果證實，細胞因子在肝纖維化形成過程中起重要參與作用[13，14]。TNF-α由激活的單核-巨噬細胞產生，是一種具有多種生物學效應的生理炎性因子。動物研究發現，TNF-α可通過加速纖維細胞增殖、擴散到相應區域加重炎性反應等途徑參與肝纖維化的形成[15]。IL-6是由單核巨噬細胞和內皮細胞產生的具有多種免疫活性和生物學功能的細胞因子，具有調控免疫應答作用，可與其他細胞因子協同作用，導致肝細胞內產生持續的炎性反應。另外，活化的肝星狀細胞可促使IL-6水平上升，而IL-6水平升高可刺激肝星狀細胞活化，兩者互呈惡性循環，導致肝星狀細胞異常活化。有研究報道，TNF-α和IL-6可參與肝硬化組織損傷-修復過程，引起肝臟細胞外基質生成、沉積，參與肝纖維化發生、發展[16]。研究報道，HIV/HCV共感染患者血清IL-6升高與肝纖維化有關[17]。研究報道，TNF-α和IL-6在肝組織損傷和肝纖維化發生過程中扮演重要角色[18]。本研究發現，PBC患者血清TNF-α和IL-6水平顯著高于健康人，且Child-Pugh C級患者血清TNF-α和IL-6水平顯著高于Child-Pugh A級或B級患者，肝組織纖維分期S3和S4期患者血清TNF-α和IL-6水平明顯高于S1或S2期患者，結果提示PBC患者血清TNF-α和IL-6水平與肝功能Child-Pugh分級和肝纖維化程度有關。

從本研究結果來看，肝組織TGF-β1及血清TNF-α和IL-6水平均與肝功能Child-Pugh分級和肝纖維化分期呈正相關關系（P＜0.05）。研究[19]指出，PBC患者血清TGF-β1升高，且與肝功能Child-Pugh分級呈正相關關系。本研究結果與其研究結果一致。血清TNF-α和IL-6水平參與了肝纖維化的發生、發展過程[20]。我們通過對肝組織TGF-β1及血清TNF-α和IL-6水平研究后認為，在炎性細胞因子TNF-α和IL-6等刺激下，肝組織分泌和釋放TGF-β1增多，導致其表達異常強化，后者可能參與了肝纖維化的形成過程，但具體機制尚有待進一步研究。

綜上所述，PBC患者肝組織TGF-β1表達增強，血清TNF-α和IL-6水平升高。隨著肝功能Child-Pugh分級和肝纖維化分期增高，肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6水平進一步增強或升高，提示肝組織TGF-β1表達及血清TNF-α和IL-6增高可能共同參與了肝臟功能的損害和肝纖維化的發生。本研究尚存在一些不足之處，如本研究樣本量較少，有待增加樣本量，進行大范圍、多中心、前瞻性研究，以提高研究結果的客觀性；TGF-β1與TNF-α和IL-6在肝功能損害和肝纖維化發生過程中的相互作用機制尚有待進一步明確。

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