HERV-HLTR相關蛋白2在肝癌中的表達及其臨床意義*

李 國，張曉峰，太云翔，代亞海,湯旭東，陳 琨

(1.四川省涼山彝族自治州第一人民醫院肝膽外科 615000；2.第三軍醫大學附屬西南醫院消化內科，重慶 400038；3.重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科 400016)

原發性肝癌是我國最為常見的腫瘤之一，在我國腫瘤相關死亡原因中居第三位。機體的免疫系統功能狀況與腫瘤的發生關系密切，一旦肝細胞癌變，機體免疫系統能通過多種免疫監視機制將癌變細胞清除，但由于肝癌細胞能夠通過多種機制逃逸免疫系統的攻擊而發病。既往的研究表明，共刺激/共抑制(Co-stimulatory/Co-inhibitory)B7家族是惟一能從抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APC)單向傳送信號給T細胞的分子。在T細胞的活化過程中，B7家族與CD28家族以配體-受體結合的形式在T細胞活化過程中提供正負雙重信號。HERV-HLTR相關蛋白2(HERV-HLTR-associating protein 2,HHLA2)是最新發現的B7家族成員。新近的研究表明，HHLA2與T細胞上可能的受體結合后，可以抑制CD4和CD8+T細胞的增殖和活化，負性調控機體免疫應答過程[1]。在多種不同器官、組織來源的腫瘤細胞中，HHLA2均呈高水平表達。目前的研究表明，在結腸癌、食道癌、腎癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、 卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及黑色素瘤中HHLA2均為過表達[2-3]。目前國內外少見文獻報道HHLA2在肝癌中的表達情況，本研究擬采用免疫組織化學檢測四川省涼山州彝族自治州第一人民醫院肝細胞癌患者腫瘤及癌旁組織中HHLA2的表達水平，探討HHLA2在患者肝癌組織表達的水平及其在肝癌患者預后中的作用。

A：陰性細胞切片對照；B：弱陽性細胞對照；C：強陽性細胞對照；D：高分化肝癌中HHLA2的表達；E：中分化肝癌中HHLA2的表達；F：低分化肝癌HHLA2的表達

圖1不同病理分級肝癌組織中HHLA2的表達(×400)

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2006-2016年在四川省涼山州彝族自治州第一人民醫院病理科存檔的150例患者肝細胞癌石蠟標本。其中男113例，女37例，年齡27～76歲，中位年齡58歲，所有患者標本均經蘇木素-伊紅(HE)染色，由病理科醫師讀片，確認為肝細胞癌患者。所有患者均在該院接受手術切除治療，采集新鮮肝癌組織和癌旁肝臟組織標本，按照病理檢查結果分為高、中、低分化，其中高分化患者58例，中分化患者67例，低分化患者25例。150例患者中，121例患者為HBV感染者。所有患者均未接受化療、放療及生物免疫治療，并且不合并其他自身免疫性疾病及其他器官腫瘤。同時收集在該院消化內科住院，并接受肝組織活檢的10例患者正常肝組織作為對照。本研究對病例資料的收集獲得該院倫理委員會審查批準。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測 所有臨床標本均用4%甲醛溶液浸泡固定，常規脫水、透明、石蠟包埋后切片，切片厚度為5 μm；切好的病理片用60 °C烤箱融化石蠟，依次經二甲苯脫蠟，并置于100%、90%、80%、70%乙醇內水化；然后將切片置0.3% H2O2中浸泡10 min以去除內源性抗原；然后將切片置于抗原修復溶液中(DAKO,S1700,USA)，微波爐加熱2 min后將切片置于蒸鍋中蒸30 min進行熱修復；然后加入小鼠抗人HHLA2單克隆抗體(RnD，USA，Clone # 907812)，1∶200稀釋，于37 °C孵育50 min；加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗鼠二抗[DAKO ENVISION+HRP,anti-mouse(K4000),丹麥]，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，染色完成后，分別在70%、80%、95%、100%乙醇中脫水各3 min，中性樹脂封片。陰性對照為磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，陽性對照為穩定轉染人HHLA2的小鼠3T3成纖維細胞組織膠石蠟切片。

1.2.2結果判斷標準 免疫組化染色的切片分別由2名資深病理科醫師雙盲獨立觀察評估，以細胞質或細胞膜出現黃色至棕褐色顆粒判定為陽性染色。首先在低倍鏡觀察切片，并隨機選取腫瘤細胞及腫瘤間質的5個高倍視野(×400)進行細胞計數，按細胞染色強度分級：無著色計0分，淡黃色著色計1分，棕黃色著色計2分，棕褐色計3分；染色陽性細胞密度百分比分級：陽性細胞數≤10%為1分，10%<陽性細胞數≤50%為2分，陽性細胞數>50%為3分；以上2項積分相乘結果≥3分為陽性表達。腫瘤細胞及腫瘤間質內任一項陽性均認定為陽性表達。

2 結 果

2.1不同病理分化肝癌組織中HHLA2的表達及分布 HHLA2在肝癌組織中的表達均增強(染色為黃色以上，1分以上)，主要表達于肝癌的細胞膜和細胞質內，呈棕黃色至棕褐色顆粒、團塊狀，呈多區域分布，HHLA2在肝癌患者中的表達陽性率為75.3%(113/150)；而HHLA2在癌旁組織中陽性率為8.6%(13/150)，而正常肝臟組織中HHLA2不表達。肝癌組織中HHLA2陽性表達率明顯高于癌旁組織和正常組織(P<0.05)。并且，在不同的病理分化程度肝癌組織中，HHLA2的表達強度亦不相同，病理分化程度低的肝癌中，HHLA2的表達更高，HHLA2在高分化組、中分化組、低分化組及對照組中的表達情況，見圖1、表1。

表1 不同病理分級肝癌組織中HHLA2的陽性表達率

a：P<0.05，與高分化組比較；b：P<0.05，與中分化組比較；c：P<0.05，與低分化組比較

2.2不同年齡分組HHLA2的表達 按患者年齡≥50歲與小于50歲分組，≥50歲患者HHLA2的陽性表達率為(41.610±1.733)%，<50歲患者HHLA2的陽性表達率為(44.480±1.600)%，兩組間HHLA2的陽性表達率差異無統計學意義(t=1.218，P=0.225 1)。

2.3不同肝功能Child-Pugh分級患者肝癌組織中HHLA2的表達及分布 在Child-Pugh分級為A級的患者HHLA2陽性表達率明顯低于肝功能B級及C級患者，肝功能B級患者與肝功能C級患者肝癌組織中HHLA2的陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同肝功能Child-Pugh分級患者肝癌組織HHLA2的陽性表達率

a：P<0.01，與A級比較

2.4不同肝癌分期患者肝癌組織中HHLA2的表達率 肝癌分期采用巴塞羅那(BCLC)分期，不同分期肝癌患者癌組織中HHLA2的表達率隨著腫瘤分期的進展逐漸升高，以巴塞羅那分期D期患者肝癌組織中的HHLA2表達率最高，A期與B期比較、 B期與C期比較差異有統計學意義(P<0.05)，C期與D期比較HHLA2表達率，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 HHLA2在不同BCLC分期肝癌組織中的陽性表達率

a：P<0.05，與A期比較;b：P<0.05,與B期比較

2.5不同血清甲胎蛋白(AFP)水平組患者肝癌組織HHLA2的陽性表達率 以血清AFP作為分組標準，將患者分為AFP≥400 μg/L組與AFP<400 μg/L組，AFP≥400μg/L組HHLA2的陽性表達率為(45.440±2.561)%，AFP<400μg/L組為(42.250±1.339)%，兩組患者肝癌組織中HHLA2的陽性表達率差異無統計學意義(t=1.00，P>0.05)。

3 討 論

免疫尤其是細胞免疫是機體抑制腫瘤發生的主要機制，T細胞是細胞免疫最重要的角色，B7家族配體與CD28家族受體是主要的T細胞共刺激/共抑制分子。既往的研究表明，這些分子在惡性腫瘤發生、發展過程中具有重要的影響，尤其是共抑制分子在腫瘤細胞的異位表達，共抑制分子配體與其受體結合后能抑制T細胞的活性，抑制T細胞增殖，并且誘導T細胞凋亡。在腫瘤細胞逃避機體的免疫監視中具有極其重要的作用，是腫瘤發生、發展的關鍵。B7家族成員PD-1與HHLA2相近，都是免疫抑制調節分子，腫瘤細胞表達PD-L1在腫瘤的免疫逃逸中發揮重要作用[4-9]；阻斷PD-l/PD-L1之間的結合之后，機體針對腫瘤的免疫殺傷明顯增強[10-12]。因此B7家族是腫瘤免疫治療重要的靶點。目前PD-l/PD-L1阻斷抗體已經上市，在臨床腫瘤免疫治療中已經顯示出良好的治療效果，大有取代傳統放化療的趨勢[13]。

HHLA2是目前發現的最新免疫共抑制分子，HHLA2主要表達于人單核細胞，可能與T細胞上尚未發現的受體結合，抑制CD4+及CD8+T細胞的活化、增殖，并且還能在體外明顯降低干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素(IL)-5、IL-10、IL-13、IL-17A及IL-22的分泌，在免疫抑制中具有重要的作用[1]。

目前的研究發現，HHLA2僅低水平表達于小腸、乳腺、腎臟、膀胱及胎盤組織的上皮細胞。其中胎盤組織中HHLA2的表達較高，原因可能是為了保護胎兒不受母體免疫系統的攻擊[2]。在本研究中采用免疫組化分析了HHLA2在肝癌及正常癌旁組織中的表達情況，結果表明HHLA2在正常組織中表達水平極低、表達率僅為(1.520±0.399)%。癌組織過表達HHLA2可造成腫瘤細胞逃避機體免疫監視，導致腫瘤發生、發展[14]。既往的研究已經發現，HHLA2在結腸癌、乳腺癌、肺癌、神經膠質瘤等腫瘤中呈陽性表達[15]，但HHLA2在肝癌組織中的表達情況，尚少見文獻報道。

本研究中發現，HHLA2在肝癌尤其是進展期肝癌組織中高度表達。HHLA2作為最新發現的免疫共抑制分子，可能在肝癌進展中發揮重要的免疫抑制作用，以幫助腫瘤細胞免遭機體免疫系統的清除。進一步的分析發現，HHLA2在高分化肝癌中的表達顯著低于中分化、低分化組，又以低分化肝癌中的表達陽性率最高，該結果提示HHLA2的表達可能與其信號通路激活有關，但目前HHLA2的受體尚未明確。

BCLC分期被認為是目前肝癌最好的分期系統，在大量的臨床研究中使用。在本研究中發現，BCLC分期以C、D期患者HHLA2的陽性表達率高，顯著高于A、B期患者，C期與D期患者之間HHLA2的表達差異無統計學意義；該研究結果表明，隨著BCLC分期的進展，HHLA2在肝癌組織中的表達也隨之增高，提示HHLA2與肝癌的生長和轉移可能存在一定的關系。并且最近的研究表明，在膠質瘤患者中，轉移灶的HHLA2表達水平明顯高于原發灶，因此認為，HHLA2亦可能在腫瘤轉移中發揮一定的作用。但AFP≥400 μg/L組與AFP<400 μg/L組患者HHLA2的陽性表達率差異無統計學意義。此外，不同年齡組患者之間肝癌組織HHLA2的表達差異無統計學意義。

本研究結果提示，HHLA2在肝癌組織中呈高表達，HHLA2可能與腫瘤的免疫逃逸有關，有研究觀察到HHLA2蛋白能夠結合到CD3陽性的T細胞表面[1]。該結果表明在T細胞表面存在HHLA2的受體，但目前HHLA2在T細胞表面的受體尚未闡明，可能HHLA2結合到 T細胞表面受體，通過抑制T細胞活化、增殖，并誘導T細胞凋亡以協助腫瘤細胞逃避機體免疫監視。

綜上所述，在肝癌患者癌組織中HHLA2的表達陽性率明顯升高，其表達可能在肝癌的發生、發展及轉移中具有一定的作用；并且，HHLA2可能作為一種腫瘤診斷、判斷預后的指標，由于HHLA2的共抑制作用在腫瘤發生、發展中具有重要作用，因此也可能作為腫瘤抗體治療的靶標[16-17]。

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