粉防己堿對先天性膈疝大鼠模型胎仔肺Rho/Rho激酶表達(dá)的影響和意義*

周 昉，黨紅星，陳應(yīng)富，白 科，方 芳，許 峰

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點實驗室 400014)

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia，CDH)發(fā)病率為1/2 000～1/3 000，病死率為20%～60%[1]。其死亡的主要原因是肺發(fā)育不良(pulmonary hypoplasia，PH)和持續(xù)性肺動脈高壓(persistent pulmonary hypertension，PPH)[2]。目前對這些主要致死病因的處理仍是臨床治療CDH的瓶頸。探索致畸因素及誘發(fā)機制，尋找積極有效的方法產(chǎn)前改善肺發(fā)育不良和肺動脈高壓將是CDH基礎(chǔ)與臨床研究的重點及防治的重要突破口之一。既往研究表明，Rho/Rho激酶信號傳導(dǎo)通路主要參與了肺動脈高壓的發(fā)病和肺纖維化形成，而粉防己堿(tetrandrine,TET)也具有肺保護(hù)作用。本研究擬測定除草醚誘導(dǎo)的CDH大鼠模型肺組織中Rho蛋白A和Rho激酶ROCK1的水平及產(chǎn)前給予TET干預(yù)后的變化，探討TET肺保護(hù)作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物模型建立和實驗動物分組 SD大鼠由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，雌雄鼠按2∶1分籠定時配種，以配種12 h后見到雌鼠陰道孕栓為孕0.5 d。孕9.5 d將受孕成功的15只孕鼠隨機分為3組：對照組、膈疝組和TET組，每組5只。采用除草醚灌胃法[3](除草醚購自浙江化工二廠，每只125 mg +2 mL橄欖油灌胃)建立膈疝組與TET組CDH模型，對照組予每只2 mL橄欖油灌胃。孕16.5 d，TET組給予TET灌胃(TET購自上海克拉瑪爾試劑公司，批號ZY160301，30 mg·kg-1·d-1，每日1次，3 d)，對照組和膈疝組給予2 mL/kg孕鼠體質(zhì)量生理鹽水灌胃。本研究符合重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2胎肺標(biāo)本收集 妊娠21.5 d，所有孕鼠在戊巴比妥鈉(0.04 g/kg)腹腔注射麻醉下剖宮產(chǎn)，取出胎鼠稱質(zhì)量后斷頭處死。再經(jīng)胸骨正中切口剖胸，完整取出左右兩側(cè)肺組織分別稱質(zhì)量，計算胎鼠肺質(zhì)量/體質(zhì)量比(Lw/Bw)，在放大鏡下觀察膈疝形成情況。

1.2方法

1.2.1胎肺組織形態(tài)學(xué)檢查和免疫組化染色 每組隨機取出22份胎肺標(biāo)本(每份含雙側(cè)肺組織)常規(guī)固定、石蠟包埋，切片(同一張切片要包括每份標(biāo)本的左右肺組織)后行蘇木素-伊紅(HE)染色。使用Image Pro Plus5.0圖像分析軟件對光鏡下圖像計算反映肺泡與肺泡腔面積的百分比，即肺泡面積比(PAA%)作為肺發(fā)育的形態(tài)學(xué)指標(biāo)；同時測定肺小動脈管壁厚度占血管外徑百分比(WT%)、中膜厚度百分比(MT%)及管腔面積與血管總面積比值(LA%)作為胎鼠肺血管形態(tài)學(xué)指標(biāo),并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。免疫組化染色采用SP法,以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對照，抗體采用anti-RhoA兔抗鼠多克隆抗體及ROCK1兔抗鼠單克隆抗體(均購自英國Abcam公司)。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性，觀察RhoA、ROCK1在各組胎鼠肺組織中的表達(dá)情況。用Nikon圖像采集儀在400倍視野下計算陽性染色顆粒積分光密度(IOD)值，IOD值與目的抗體表達(dá)強弱呈正相關(guān)。

1.2.2Western blot法檢測胎肺組織RhoA蛋白及Rho激酶表達(dá)情況 實驗3組分別取10份肺組織標(biāo)本提取蛋白質(zhì)，Bradford法定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉加入抗體RhoA或ROCK1一抗(均購自英國Abcam公司)、孵育后加二抗、DAB顯色。將目的條帶蛋白表達(dá)量轉(zhuǎn)換為內(nèi)參照β-actin校正的灰度值進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1胎鼠膈疝形成情況 對照組獲得胎仔49只，無膈疝形成；膈疝組獲胎仔55只，形成膈疝36只，致畸率65.45%；TET組獲胎仔51只，形成膈疝32只，致畸率62.75%；除草醚總致畸率為64.15%；膈疝組和TET組的致畸率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。膈疝形成大多位于左側(cè)(共56只，占膈疝總數(shù)的83.82%)，疝內(nèi)容物主要為胃、小腸，其次為肝臟，左側(cè)膈疝中巨大膈疝共21只，占左側(cè)膈疝37.5%；右側(cè)膈疝胎仔共11只，均無巨大膈疝形成；雙側(cè)膈疝1只。

2.2胎肺形態(tài)學(xué)觀察及肺發(fā)育的形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果 HE染色觀察，對照組肺組織發(fā)育良好，肺泡結(jié)構(gòu)明顯，腺泡大，肺泡間質(zhì)薄而均勻，呼吸性支氣管末端呈囊泡狀,肺小動脈血管壁薄腔大，內(nèi)皮細(xì)胞分布均勻，中膜無增厚；膈疝組胎肺發(fā)育差，肺泡少且小，間質(zhì)厚，肺泡、肺泡管及肺泡囊呈假腺體樣改變,有明顯肺發(fā)育不良表現(xiàn)，肺小動脈血管肌層肥厚，管壁明顯厚且管腔窄；TET組肺發(fā)育接近對照組，好于膈疝組，光鏡下示肺泡變大，肺泡間質(zhì)變薄，肺小動脈管壁變薄，管腔狹窄程度較膈疝組減輕(圖1)。實驗各組肺發(fā)育的形態(tài)學(xué)指標(biāo)Lw/Bw、PAA%、肺小動脈WT%、MT%和LA%計算結(jié)果表明，膈疝胎鼠存在肺發(fā)育不良和肺血管重構(gòu)，TET能有效地改善肺組織發(fā)育，與膈疝組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 各組胎肺HE染色(×200)

組別nLw/BwPAA%WT%MT%LA%對照組224．24±0．3158．81±2．9213．50±1．4516．47±2．0761．20±3．23膈疝組222．11±0．36a33．60±3．12a26．64±2．41a25．98±2．79a38．58±2．15aTET組223．61±0．24ab42．46±3．68ab16．02±2．35ab17．96±1．95ab56．07±3．32abF253．17339．697238．399108．428355．571P0．0000．0000．0000．0000．000

a：P<0.05，與對照組相比;b:P<0.05，與膈疝組相比

圖2 各組胎肺RhoA及ROCK1表達(dá)情況(免疫組化×400)

組別nIOD值RhoA(IOD×103)ROCK1(IOD×103)n蛋白表達(dá)RhoA蛋白ROCK1蛋白對照組2216．54±2．0310．38±2．28100．48±0．080．27±0．06膈疝組2250．51±2．25a39．24±2．71a101．33±0．18a0．83±0．07aTET組2228．44±1．92ab17．03±1．15ab100．82±0．08ab0．43±0．06abF1536．981084．604123．138216．680P0．0000．0000．0000．000

a：P<0.05，與對照組相比;b：P<0.05，與膈疝組相比

A:Western blot；B：RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)情況

圖3 Western blot檢測RhoA、ROCK1蛋白水平的表達(dá)

2.3胎肺組織免疫組化檢測結(jié)果 膈疝組中，胎肺支氣管上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺間質(zhì)內(nèi)見大量棕黃色顆粒，RhoA及ROCK1的表達(dá)明顯強于對照組；TET組RhoA、ROCK1的表達(dá)較膈疝組降低，陽性范圍面積縮小，接近于對照組(圖2)。實驗各組RhoA和ROCK1表達(dá)情況由低到高依次是對照組、TET組、膈疝組(P=0.000)，3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，見表2。

2.4胎肺組織RhoA及Rho激酶ROCK1蛋白表達(dá)情況 膈疝組胎肺組織RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)量較對照組顯著增加(P=0.000)，與膈疝組相比，TET組RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)量明顯降低(P=0.000)，見表2、圖3。

3 討 論

自1990年KLUTH等[4]報道以來，用除草醚灌胃誘導(dǎo)懷孕大鼠產(chǎn)生膈疝胎鼠已經(jīng)成為一種相對成熟的經(jīng)典的CDH建模方法,廣泛用于國內(nèi)外關(guān)于膈疝的研究。本研究成功復(fù)制CDH模型，致畸率64.15%。CDH患兒的根本死亡原因是肺發(fā)育不良和持續(xù)性肺動脈高壓，這些病理過程在患兒出生前即已完成。本研究中，膈疝組光鏡下可觀察到，與正常胎肺相比，膈疝組胎肺相對質(zhì)量輕，胎肺肺泡小而少，間質(zhì)增厚，呼吸性支氣管末端囊泡狀結(jié)構(gòu)少見；肺小動脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，這些形態(tài)學(xué)改變支持膈疝胎鼠存在肺發(fā)育不良和肺血管重構(gòu)。目前治療膈疝的方法多樣，但無論是產(chǎn)前使用糖皮質(zhì)激素、胎兒外科還是產(chǎn)后手術(shù)、使用肺表面活性物質(zhì)、降肺動脈高壓等治療手段均不能實現(xiàn)病因治療，也不能改善存活率。

Rho/Rho激酶信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號分子包括Rho蛋白、Rho激酶和肌球蛋白磷酸酶，Rho蛋白屬于Ras蛋白超家族，RhoA是最常見的Rho蛋白異構(gòu)體之一。Rho激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是RhoA的下游靶效應(yīng)分子。近年來，Rho/Rho激酶信號傳導(dǎo)通路被證實在肺動脈高壓發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，該信號通路的選擇性抑制劑能夠顯著抑制肺動脈高壓動物肺血管收縮和肺血管重建的進(jìn)展[5]。TAKAYASU等[6]對除草醚誘導(dǎo)的CDH模型研究發(fā)現(xiàn)CDH胎仔肺血管中RhoA表達(dá)增高且具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖作用，認(rèn)為RhoA介導(dǎo)的血管收縮參與了CDH中PH的發(fā)病機制。本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，膈疝組RhoA及Rho激酶ROCK1在肺泡上皮細(xì)胞和肺間質(zhì)內(nèi)呈陽性表達(dá)，在肺小動脈平滑肌細(xì)胞也能見到明顯的棕黃色顆粒；同時Western blot檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，RhoA及ROCK1蛋白表達(dá)在膈疝組明顯升高。已有研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)內(nèi)肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化是肺動脈高壓的分子基礎(chǔ)，PASMCs的收縮取決于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)MLC磷酸化程度，而MLC磷酸化受肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chainkin-ase,MLCK)和肌球蛋白磷酸酶(myosin phosphatase,MP)之間動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)，這一過程受到Rho/Rho激酶信號通路的活化調(diào)控，促進(jìn)PASMCs鈣調(diào)敏感性收縮及細(xì)胞增殖、遷移，使血管中膜明顯增厚，非肌性小動脈肌化，管腔狹窄，從而在肺血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[7-8]。另還有研究發(fā)現(xiàn)，成肌纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積作用有賴于RhoA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Rho激酶特異性抑制劑可抑制肺纖維化的發(fā)生，對肺有保護(hù)作用[9]。結(jié)合前述免疫組化及Western blot的研究結(jié)果，聯(lián)系本實驗光鏡下膈疝組與對照組相比胎仔肺發(fā)育及肺血管形態(tài)學(xué)的指標(biāo)變化，提示在除草醚誘導(dǎo)的膈疝中存在Rho/Rho激酶信號通路的作用。據(jù)此推測該信號通路在除草醚誘導(dǎo)膈疝模型胎仔肺血管重構(gòu)過程中起重要作用，并能影響膈疝胎鼠的肺發(fā)育，它可能通過直接影響平滑肌細(xì)胞收縮、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能參與肺動脈高壓和肺發(fā)育不良的形成。

本研究也對除草醚誘導(dǎo)的膈疝孕鼠產(chǎn)前給予TET灌胃干預(yù)。TET是一種雙芐基異喹啉類生物堿，為傳統(tǒng)中藥粉防己的主要成分[10]；作為一種新型的鈣通道阻滯劑，TET具有調(diào)節(jié)血管舒縮、抗纖維化、抗氧自由基、抗炎等生物學(xué)效應(yīng)，其藥理作用廣泛[11-12]。有動物實驗發(fā)現(xiàn)，TET可顯著降低慢性低氧性肺動脈高壓大鼠平均肺動脈壓和肺血管阻力，并能抑制肺組織和肺動脈壁膠原水平的增加[12-13]。細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)，TET具有抑制體外培養(yǎng)的PASMCs增殖的作用，這種作用可能有助于抑制伴有肺血管重構(gòu)的肺動脈高壓[12]。產(chǎn)前干預(yù)研究還發(fā)現(xiàn)TET可改善CDH胎鼠肺組織發(fā)育[3]。如前所述，Rho/Rho激酶信號通路有參與肺動脈高壓發(fā)病機制及參與肺纖維化的作用，而作為鈣通道阻滯劑的TET恰好具有調(diào)節(jié)血管舒縮、抗纖維化的作用，且已被應(yīng)用于矽肺、高血壓、肺動脈高壓、腫瘤放療增敏等的臨床治療[11-12]。本實驗檢測了TET產(chǎn)前干預(yù)的CDH胎鼠肺組織RhoA及ROCK1表達(dá)情況，與膈疝組相比，RhoA及Rho激酶ROCK1的表達(dá)水平均有明顯下降，提示TET的干預(yù)抑制了RhoA及Rho激酶的作用。同時在光鏡下觀察TET干預(yù)的CDH胎鼠肺組織，與膈疝組相比，胎鼠肺Lw/Bw、PAA%等肺發(fā)育指標(biāo)及WT%、MT%和LA%等肺血管重構(gòu)指標(biāo)明顯更優(yōu)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示與膈疝組相比，TET組改善了CDH胎鼠肺發(fā)育不良；同時，改善了肺小動脈管壁變厚管腔變窄的情況，表明TET在促進(jìn)CDH胎鼠肺發(fā)育，改善肺血管重構(gòu)方面有效。由此推測TET可通過調(diào)節(jié)Rho/Rho激酶信號通路對胎肺發(fā)揮保護(hù)作用。

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