肝細胞癌的全基因組關聯研究進展*

吳葉嬌，張金坤，周春曉，陳衛昌 綜述，余 強Δ 審校

(1.南京醫科大學附屬蘇州醫院/蘇州市立醫院消化內科 215002；2.蘇州大學第一附屬醫院消化內科，江蘇蘇州 215006)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)起源于構成肝臟實質的肝細胞，是原發性肝癌的最常見組織學類型，約占原發性肝癌的85%～90%。HCC是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，分別居男性惡性腫瘤的第5位和女性惡性腫瘤的第7位[1]。HCC的發病率在全球范圍內的分布并不均勻，絕大多數出現(大于80%)在撒哈拉以南的非洲和東亞地區；中國的年齡標準化發病率男性達37.4/10萬，女性13.7/10萬[2]，僅中國的病例數就在全球所有HCC患者中占大約50%[3]。然而在北美洲、南美洲及歐洲，HCC的發病率相對較低。這種顯著的差異是由多種因素造成的。HCC涉及多重遺傳和環境因素的共同作用[4]。HCC患者預后差，平均3年生存率僅為13%～21%[5]。如此高的全球疾病負擔使得識別HCC高危個體和可控的危險因子顯得尤為重要。已知數個增加HCC風險的環境因素，如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的感染、接觸黃曲霉毒素和大量飲酒、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病和血色病[3,6-7]。然而，人群中僅一小部分暴露于這些危險因素的個體最終罹患HCC，這充分突顯出遺傳易感性是另一個影響HCC發生、發展的重要因素。

目前，血清甲胎蛋白水平測定和肝臟的影像學檢查是高危人群篩查的主要手段。然而，這兩種技術的靈敏度較低，使得它們的有效性受到限制。此外，它們并非旨在識別高危個體，而是已經罹患HCC的患者。未來的醫學實踐將緊緊圍繞4P概念，即預測性(predictive)、個體化(personalized)、搶占性(preemptive)和實踐性(participatory)[8]。其實，在此框架內，目前尚不存在與之相符的HCC遺傳標記。因此，與HCC風險增高相關的分子標記將會成為識別高危個體策略中的一種非常有價值的上游工具，自然也會在預防性干預中扮演特殊的角色。

隨著基因組學領域的快速發展，整個人類基因組序列完成，二代測序技術出現，基因檢測成本相對降低，以及新分析工具應用，讓HCC研究領域出現重大的革新性改變。這些進展使得對基因組中成千上萬的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)進行快速基因型分型成為可能，這就直接促成了全基因組關聯研究(genome-wide association study,GWAS)的出現和發展。隨之，許多與HCC有關聯的遺傳易感性位點通過GWAS被發現，為HCC的發病機制研究提供了新的重要線索。本文系統介紹GWAS應用于HCC發病機制研究的最新進展。

1 全基因組關聯研究

候選基因策略曾經最為廣泛地應用于研究復雜性疾病發生、發展和治療效果的遺傳因素。這種方法是有假設前提的，并因依賴于對候選基因在生理、生物化學或功能等方面的先驗知識。因此候選基因策略受到極大的限制。這種局限性導致信息瓶頸而往往引起已報道實驗結果缺乏一致性。但GWAS的出現徹底打破了這一局限。

GWAS是一種利用人類全基因組高通量測序和分型的技術，對研究對象的整個基因組中的SNPs進行分型。通常，其研究對象有超過數十萬個SNPs，傳統技術難以快速測序，但GWAS可以做到。同時，GWAS利用生物統計學和生物信息學的方法，檢驗SNPs與復雜疾病或特定遺傳性狀的關聯性，由此全面地揭示與疾病發生、發展及治療相關的遺傳位點。GWAS的理論來源于人類常見的復雜性疾病，主要是以常見的等位基因遺傳變異為遺傳基礎[9]。通常，GWAS是利用覆蓋人類基因組的高密度SNPs來尋找目標人群(有復雜性疾病或特定遺傳性狀者)和對照人群之間等位基因頻率的差異。如果差異存在統計學意義，就提示在其基因組相應區域可能存在具有潛在功能并且與所研究的復雜性疾病或特定遺傳性狀有關聯的DNA序列變異。隨后在新的標本中將繼續進行驗證這種有統計學意義關聯是否仍然存在[10]。

GWAS一般有如下4個步驟[11]：(1)研究設計和準備階段。包括查閱相關文獻、提出科研假說、進行科學研究設計、招募合格的研究對象和對照個體、問卷調查和采集生物學標本。(2)實驗室基因分型階段。包括制備DNA、準備芯片及基因分型和實驗室的質量控制等。(3)數據分析階段。包括調查資料的整理匯總、基因分型資料整理匯總[如缺失值的控制、最小等位基因頻率的控制、Hardy-Weinberg連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)的檢驗、親屬關系的鑒別等][12]、人群分層分析(鑒別種族和調整人群的混雜效應)、各遺傳位點與復雜性疾病或特定遺傳性狀的效應分析，進而分析每個基因、每條通路與復雜性疾病或特定遺傳性狀的關聯，以及基因-環境和基因-基因的交互作用。(4)重復驗證階段。對新發現的易感位點或基因，在同類人群和(或)其他種族人群中進行進一步驗證，評價該研究結果的可重復性，以減少假發現率的產生[13]。

表1 GWAS報道的HCC相關遺傳易感位點

1996年GWAS由RISCH等[14]提出，總結了GWAS所需的技術和統計學分析方法，并指出當時GWAS的主要缺乏技術支持而非統計學分析方法。1990年人類基因組計劃啟動，旨在完成人類基因組測序圖。第一階段的成果公布于2001年。同年，另一個標志性項目啟動，即國際人類基因組單體型圖計劃。該研究記錄了人類基因組中大量共同的SNPs并確定了LD的模式和這些變異等位基因之間的關聯性。該研究為商業性基因型分型芯片奠定了選擇遺傳標志物的基礎并使日后的GWAS工作進展順利。2005年Science雜志發表了有關GWAS的文章[15]。自此，與GWAS相關的文獻發表量逐年增加，幾乎覆蓋了所有復雜性疾病和特定遺傳性狀的表型，報道了許多與復雜性疾病和特定遺傳性狀有統計學關聯的SNPs，并在不同種族的或更大的人群中得到驗證。由此可見，GWAS已經成為目前人類復雜性遺傳性狀和疾病的遺傳易感性的主要研究策略。

2 GWAS與HCC

目前，GWAS所發現的與HCC可能相關的遺傳易感位點已經達到20個，見表1。其中，針對部分遺傳易感位點已經開展了相關生物學功能研究，結果提示部分遺傳易感位點在HCC的發生和發展過程中可能發揮重要的作用。本文針對數個遺傳易感位點的GWAS結果和致病機制進行綜述。

2.1KIF1B 2010年ZHANG等[16]在華裔人群中采用Affymetrix的人類全基因組SNP芯片對355例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和360例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者進行初篩。在440 794個標記SNPs中發現，在染色體1p36.22上KIF1B基因內的rs17401966變異與乙型肝炎后HCC顯著相關。隨后在5個獨立人群中分別進行了重復驗證。這5次驗證的研究對象總人數達1 962例HCC合并慢性HBV攜帶的患者、1 430例慢性HBV攜帶但無HCC對照患者以及159個家系，均為華裔。經上述6次研究證實該位點與乙肝后HCC的發病有統計學關聯(6次研究合并P=1.7×10-18，OR=0.61，95%CI：0.55～0.67)。然而，之后的研究并未得出相同的結論。AL-QAHTANI等[17]報道，在KIF1B基因內的rs17401966變異和乙肝后HCC之間無顯著的相關性。SAWAI等[18]在日本人的一項隊列研究中也并未發現該兩者的相關性。這些大相徑庭的結果可能部分因為不同研究人群的遺傳構架差異。另一個可能的原因是忽略了在HCC的發生和發展過程中存在復雜的基因-環境交互作用。近期CHEN等[19]在中國人群的一項研究表明KIF1B基因內的rs17401966變異與飲酒之間存在基因-環境交互作用并在HCC的發生、發展過程中發揮重要作用。

1p36的雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)是多種腫瘤中的常見遺傳缺陷，包括HCC[20-22]。1p36.21-36.22內的LOH可能是肝臟癌變的初始事件之一，這意味著該區域可能存在HCC的抑癌基因[22]。rs17401966處在一個224 kb的LD模塊內，該模塊含UBE4B的3′端，KIF1Bα和PGDβ。KIF1B是一個驅動蛋白超家族成員，編碼兩個選擇性剪接的亞型，KIF1Bα和KIF1Bβ；這兩個亞型形成同源二聚體，運輸線粒體和突觸囊泡前體。KIFs的下調對某些腦部、結腸、乳腺的腫瘤具有致癌作用[23]。兩個獨立的研究均證實KIF1B可能是成細胞纖維瘤的一個潛在抑癌基因，作用于EglN3脯氨酸羥化酶的下游誘導細胞凋亡[23-24]，最終導致惡變和進展得到抑制。所以KIF1B很可能是一個抑癌基因。

2.2DEPDC5 2011年MIKI等[25]在日本人中采用Illumina HumanHap芯片對212例慢性HCV合并HCC感染的患者和765例慢性HCV感染但無HCC的對照患者進行初篩。在467 538個SNPs中，發現在染色體22q12.2-3上DEPDC5基因內的rs1012068與丙型肝炎后HCC顯著相關。隨后在710例慢性HCV合并HCC感染的患者和1 625例慢性HCV感染但無HCC的對照患者中進行獨立的重復驗證，經調整性別、年齡和血小板計數后證實，該位點與丙肝后HCC的發病有統計學關聯(合并P=1.35×10-14，OR=1.96，95%CI：1.65～2.32)。雖然曾有報道稱DEPDC1影響膀胱癌的發生[26]，該基因含有與DEPDC5類似的DEP結構域，但是DEPDC5的功能目前仍然未知。

近期BURZA等[27]在歐洲裔人群中進行的病例對照研究并未發現DEPDC5基因內的rs1012068變異與HCC的相關性。但研究者注意到該變異與中至重度纖維化相關。肝硬化，是纖維化最嚴重的等級，也是HCC的主要危險因素[28]。在MIKI等[25]的研究中，大部分HCC患者很有可能同時存在肝硬化。然而對照組的患者并非丙型肝炎后肝硬化而無HCC的患者。所以，MIKI等[25]找到的關聯性可能實際上是DEPDC5基因內的rs1012068與嚴重肝纖維化相關而非HCC。為進一步明確分子機制，BURZA等[27]對肝星狀細胞(LX-2)進行了體外研究，結果表明DEPDC5基因的下調導致catenin表達及其下游目標基質金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP2)的產生量有所增加。而MMP2是一個與肝臟纖維化密切相關的酶。

2.3MICA 2011年KUMAR等[29]在日本裔中采用Illumina HumanHap芯片對721例HCV所致HCC的患者和2 890例無慢性HCV感染的對照者進行初篩。隨后在673例HCV所致HCC的患者和2 596例無慢性HCV感染的對照者中進行重復驗證。在432 703個常染色體SNPs中，染色體6p21.33上的MICA基因內的rs2496542與丙肝后HCC的發病顯著相關(合并P=4.21×10-13，OR=1.39，95%CI：1.27～1.52)。

MICA基因編碼一個膜結合蛋白，是自然殺傷(natural killer,NK)細胞表面的自然殺傷細胞組2D(natural killer cell group 2D,NKG2D)的配體。這些NK細胞通過分泌穿孔蛋白和顆粒酶及死亡受體信號發揮細胞毒性作用，也釋放炎癥細胞因子以起到抗病毒和對感染和腫瘤免疫應答的效果[30]。因此MICA/NKG2D系統是免疫監視的有效機制。病毒通過破壞MICA的產生以拮抗MICA-NKG2D系統的抗腫瘤作用。而rs2596542正處于MICA轉錄起始位點的上游。腫瘤細胞也逐漸形成了通過脫落酶使MICA從細胞表面脫落，拮抗MICA/NKG2D激活的信號[31]，從而盡可能減少或躲避NKG2D介導的應答機制。血清sMICA的水平在HCC晚期的患者中升高，且與NKG2D表達的下調和NK細胞活性下降相關[32]。這些實驗結果均表明NK細胞的功能障礙在逃脫腫瘤監視系統中扮演重要角色[33]。

2.4HLA-DQA1/DRB1與GRIK1 2012年LI等[34]在華裔中對1 538例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和1 465例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者進行初篩。隨后在總人數為3 133例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和3 699例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者中進行兩次獨立的重復驗證。結果在523 663個常染色體SNPs中，發現染色體6p21.32上的HLA-DQA1/DRB1基因(功能性研究在其后的HLA-DQ基因中共同進行闡述)內的rs9272105變異和染色體21q21.3上的GRIK1基因內的rs455804變異與乙肝后HCC的發病顯著相關(合并P=5.24×10-22，OR=1.28，95%CI：1.22～1.35；P=5.24×10-10，OR=0.84，95%CI：0.80～0.89)。

GRIK1編碼GLUR5，是一種促離子型谷氨酸受體，作為配體激活通道的亞基參與谷氨酸信號。谷氨酸通過多種分子機制在神經膠質瘤的惡性表型中起關鍵作用[35]。抑制谷氨酸的釋放和(或)谷氨酸受體活性可以有效減少乳腺癌、喉癌和胰腺癌的腫瘤細胞增殖和(或)侵襲[36-38]。LI等[34]研究更進一步驗證了谷氨酸信號通路在癌癥發生和發展中的重要作用，同時對乙型肝炎后HCC的機制研究具有指導意義。

2.5STAT4與HLA-DQ 2013年JIANG等[39]采用Illumina芯片在中國人群中對1 161例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和1 353例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者進行初篩。隨后在總人數為4 319例HCC合并慢性HBV攜帶的患者和4 966例慢性HBV攜帶但無HCC的對照患者中進行兩個階段的重復驗證。研究結果顯示，在568 280個常染色體SNPs中，染色體2上STATA基因內的rs7574865變異和染色體6上的HLA-DQ基因內的rs9275319變異與乙型肝炎后HCC的發病顯著相關(合并P=2.48×10-10，OR=1.21，95%CI：1.14～1.28；P=2.72×10-17，OR=1.49，95%CI：1.36～1.63)。

信號轉導及轉錄激活子(signal transducers and activators of transcription,STAT)可調節造血過程并通過抑制或誘導生長因子和特定的細胞因子影響腫瘤細胞與其免疫微環境的相互作用[40-41]。其中，STAT4基因在免疫反應的過程中扮演重要的角色。由抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells,APCs)或具有類似APCs功能的細胞分泌的白細胞介素-12激活STAT4；活化的STAT4能促進像NK細胞等的炎癥細胞分泌干擾素(interferon,IFN)-γ[42]。IFN-γ是干細胞凋亡、肝臟再生、病毒控制和抑制腫瘤的關鍵細胞因子。STAT4表達的不平衡能夠通過炎性反應、T細胞分化的調控和IFN-γ導致自身免疫性疾病或腫瘤[43]。這些都表明STAT4可能參與HCC發生和發展的病理過程。

HLA系統是編碼人類主要組織相容性復合體的基因座的名稱。這個超級基因座包含大量與人類免疫系統功能相關的基因。HLA Ⅱ類分子包括3個同種型：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。已有大量文獻報道了它們與HCC之間的相關性，而LI等[34]和JIANG等[39]有關GWASs的研究從另一個角度再次證實了這一點。rs9272105位于HLA-DQA1和HLA-DRB1之間，而rs9275319位于HLA-DAB1和HLA-DQA2之間。HLA-DQ和-DR編碼的蛋白質組成HLAⅡ類復合物，這是一種表達于抗原呈遞細胞表面的α-β異質二聚體膜糖蛋白，例如B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。HLAⅡ類糖蛋白為CD4+T細胞呈遞病毒多肽從而影響免疫反應。因此HLA-DQ和-DR基因的SNPs在免疫介導的疾病中具有重要的地位，包括肝病和HCC。而WEN等[44]的近期研究發現rs9272105與HBV的基因型和變異存在顯著的相關作用，并進一步揭示HLA-DQ/DR基因的多態性可能通過調節HBV變異的免疫選擇而影響慢性HBV感染的結局，從而增加了因HBV變異導致HCC的風險。

3 GWAS的總結和展望

在GWAS中發現了大量HCC的易感位點，為深入研究其生物學發病機制起了指導性作用。與先前的研究方法相比，GWAS的最大優勢是在研究前不需要提出致病位點所在基因組的生物學假設，而是從基因組的所有SNPs中進行篩選。采用高通量技術，輔以大樣本量和重復驗證，極大地提高了GWAS從海量基因組信息中篩選出與HCC相關遺傳變異的效能。后續的生物學通路分析部分證實了GWAS所發現的基因的潛在作用。

但GWAS并非完美無瑕。首先，GWAS只能揭示與疾病相關的基因而不能直接驗證這些基因導致疾病，因為與疾病的相關的基因與導致疾病的基因可能存在LD[45]。因此，需要功能性分析來驗證GWAS所發現的HCC候選基因。其次，篩選出的位點僅能解釋表型遺傳的一小部分[46]。所以發現罕見變異仍然是一個問題，亟待解決[47]。另外，GWAS關注的是疾病的易感性，但并不能夠反映疾病的其他方面，例如進展、嚴重程度或預后[48-49]。因此，有研究者在經典的GWAS基礎上提出了彌補的策略和方法。隨著新一代測序技術的出現和發展，GWAS將不斷吸收和利用新的技術，并將其應用到將來的研究中。

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