P16和Ki-67在宮頸鱗狀上皮內病變中的表達*

丁莉利,牛海艷,楊 丞，鄭 晶

(海南醫學院病理學教研室,海口 571199)

《WHO女性生殖器官腫瘤學分類(第4版)》對宮頸鱗狀細胞癌前病變采用二級分類法，即分為低度鱗狀上皮內病變(LISL)和高度鱗狀上皮內病變(HISL)[1]。該分類法更能反映病變的生物學行為，且與臨床治療方案相關，因此臨床要求在宮頸組織學活檢診斷中應明確區分LSIL與HSIL。新分類的HSIL包括宮頸上皮內瘤變(CIN)2和CIN3病變，但以往根據形態診斷的CIN2可能部分為LSIL、部分為HSIL，籠統將CIN2都歸入HSIL，可能導致HSIL的擴大化。研究提示P16和Ki-67是有助于區分宮頸鱗狀上皮內病變的免疫標志物,但不同文獻采用不同的判讀標準[2-6]。本研究將探討P16和Ki-67在宮頸鱗狀上皮內病變中的表達水平和表達方式，分析它們在宮頸鱗狀上皮內病變中的診斷意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集海南醫學院第一附屬醫院病理科2015年1月至2015年12月的宮頸組織石蠟包埋標本，選取診斷明確的LSIL、HSIL標本各 40例。所有宮頸組織均為宮頸活檢和LEEP刀標本。

1.2方法 所有標本經4%中性緩沖甲醛液固定，常規脫水，石蠟包埋，4 mm厚切片，HE染色，光鏡觀察。免疫組織化學染色采用EnVision法，抗原修復采用高壓高溫煮沸法，所用單克隆抗體P16、Ki-67和顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術開發有限公司，操作步驟按說明書進行。

1.3結果判定 P16染色定位于細胞核和細胞質，Ki-67染色定位于細胞核。P16染色結果判讀依陽性細胞在鱗狀上皮分布的垂直平面行半定量報告：P16染色以超過上皮層下1/3以上彌漫且強的染色為1+，超過上皮層下2/3以上彌漫且強的染色為2+。Ki-67染色結果判讀依陽性細胞數行半定量報告：陽性細胞數占11%～30%為1+，31%～50%為2+,>50%為3+。Ki-67陽性細胞數小于或等于10%或僅基底及基底旁細胞著色均判為陰性。所有病例均經2位高年資病理醫生在多投顯微鏡下討論，并確定診斷。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件對數據進行處理。計數資料以頻數或百分率表示，比較采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1P16在不同宮頸鱗狀上皮內病變中的表達情況 P16在LISL組、HSIL組中陽性表達率分別為17.5%(7/40)、100%(40/40)，兩組之間差異有統計學意義(χ2=56.17，P<0.01),P16在HSIL組中的陽性表達率顯著高于LSIL組，見表1。P16在LISL組中雖有7例染色陽性，但強染色均未超過上皮層下2/3。另有18例LISL病例P16出現斑駁或弱的染色,均判為陰性(圖1)。P16在HSIL組中染色均超過上皮層下l/3,且34例呈超過上皮層2/3或全層表達，呈連續、彌漫強表達(圖2)。

2.2Ki-67在不同宮頸鱗狀上皮內病變中的表達情況 Ki-67在LISL組、HSIL組中總陽性表達率分別為87.5%(35/40)、100%(40/40)，在兩組之間差異無統計學意義(χ2=3.41，P>0.05)，見表1。但Ki-67染色細胞數在兩組之間有顯著性差異(Z=7.60，P<0．01)，Ki-67在HSIL組中染色陽性細胞數比LSIL組多。LISL組Ki-67陽性病例的染色細胞不僅數量上以1+為主，而且染色細胞主要位于上皮層的下1/3，中上層僅個別細胞表達(圖3)。HSIL組病例的Ki-67染色細胞數量上以2+及以上為主，且上皮層1/3以上、甚至全層有大量染色細胞分布(圖4)。

表1 P16和Ki-67在宮頸鱗狀上皮內病變中的表達(n)

表2 Ki-67在 P16 1+表達的宮頸鱗狀上皮內病變中的表達(n)

2.3Ki-67在 P16 1+表達的宮頸鱗狀上皮內病變中的表達情況 P16在LSIL組、HSIL組分別有7例和6例為1+表達，占全部病例數的16.25%(13/80)。若P16 1+表達的病例以Ki-67 1+表達為標準判為LSIL,以Ki-67 2+及以上表達為標準判為HSIL，則分別有4例LSIL和4例HSIL的組織學類型與免疫表型相符合，僅5例P16 1+表達的病例免疫表型與組織學類型不符，占全部病例數的6.25%(5/80)。見表2。

圖1 LISL中P16呈弱的染色(×400)

圖2 HISL中P16呈彌漫、強染色(×400)

圖3 LISL中Ki-67呈1+表達(×400)

3 討 論

宮頸鱗癌的癌前病變與高危人類乳頭瘤病毒(HPV)感染關系密切。患者在感染高危HPV后，HPV的DNA在機體內以2種形式存在，即游離形式和整合形式。HPV DNA在細胞內以游離狀態存在時，組織學形態上表現為正常或LSIL，絕大部分感染者將通過自身免疫機制清除病毒。大量的回顧性研究顯示，經活檢證實的LSIL整體預后良好，大部分病例會在1年之內消失。若持續性高危型HPV感染，病毒的DNA可發生斷裂，并與宿主細胞的基因整合，組織學形態上常表現為HSIL。如果不經過恰當的治療，大約1/3的HSIL可以在30年間進展為癌。因而從臨床目前規范的宮頸病變處理的流程來看，對于病理診斷為LSIL的患者僅需隨診觀察，而HSIL患者則需要根據情況進行臨床治療[7]。因此宮頸組織學活檢診斷區分LSIL與HSIL有重要的臨床意義。CIN分為3級：CIN1、CIN2和CIN3。第4版WHO(2014)女性生殖系統腫瘤分類將CINl 病變歸入LSIL,將CIN2和CIN3病變歸入HSIL[1]。有文獻報道，不同病理醫師對于CIN2級病變的診斷一致性僅為43%[8]。因此不能簡單地將活檢診斷的CIN2都歸入HSIL,需要對這樣的病變進行進一步的區分。

當HPV DNA整合到宿主細胞基因組中，病毒DNA上的E6、E7癌基因表達蛋白能引起自身調節和宿主調節基因表達失調，從而影響正常細胞周期調控，導致宮頸上皮細胞發生惡變。其中E7蛋白能結合pRb蛋白，失活的pRb可以反饋性刺激抑癌基因P16表達，研究認為P16的強陽性表達即意味著HPV在細胞中的整合[9]，這提示P16可作為HSIL診斷的標志物。本研究中P16在HSIL組中的表達陽性率明顯高于LISL組，且在HSIL中呈連續、彌漫強陽性表達，并以超過上皮層下2/3或達全層的表達模式為主。而P16在LISL組中不但表達陽性率低，且陽性表達病例的染色也主要位于上皮層下2/3以內。因此在對宮頸鱗狀上皮內病變進行診斷時，不僅應慎重判斷P16 的陰陽性，應還對陽性病例仔細觀察P16在上皮中的表達模式。

Ki-67是一種檢測細胞增殖的標志物,在除G0期外所有細胞周期上都有表達，它在非腫瘤性宮頸鱗狀上皮中限于基底層及副基底層。HPV感染會導致上皮細胞增殖，且以往的研究顯示Ki-67染色的強度與宮頸鱗狀上皮異型增生的級別呈正比[10]。雖在本研究中Ki-67在LSIL組和HSIL均有很高的陽性表達率，但在染色細胞數量和分布模式上有很大不同。Ki-67在LISL組病例中的染色細胞不僅數量上以1+為主，而且染色細胞主要位于上皮層的下1/3，中上層僅個別細胞表達，而在HSIL組中Ki-67染色細胞數量上以2+及以上為主，且上皮層1/3以上、甚至全層有大量染色細胞分布。因此在對宮頸鱗狀上皮內病變進行診斷時，對Ki-67染色結果的判斷應著重于判斷Ki-67染色細胞數量和分布模式。

本研究也發現若單獨行P16免疫組織化學檢測，雖大部分LSIL和HSIL病變能得到明確區分，但部分LSIL和HSIL病變的P16在表達強度上存在重疊。文獻報道在病理形態典型的 LSIL 中，大約有 1/3 病例顯示累及基底層和副基底層的彌漫性 P16 免疫染色[11]。因此P16 陽性不能作為判讀 HISL 的絕對指征，在宮頸鱗狀上皮內病變中單獨行P16免疫組織化學檢測將會影響診斷的準確性。本研究發現Ki-67染色細胞的數量和分布模式在LSIL和HSIL中有明顯不同。在HSIL組中Ki-67染色細胞的數量以2+及以上為主，且上皮層1/3以上、甚至全層有大量染色細胞分布。以Ki-67 2+及以上表達為標準將P16 1+表達的宮頸鱗狀上皮內病變判為HSIL，可對這部分病例做進一步區分，降低診斷不明的病例數比率。因此P16和Ki-67免疫組織化學聯合檢測在宮頸鱗狀上皮內病變中具有重要的診斷價值。

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