抑制DNA-PKcs對放射治療后食管鱗癌細胞系EC109自噬蛋白表達和增殖的影響*

孫 佳，趙曉靜，袁 翎，李雨濛，李 南，張中冕，王豪勛，韓 娜，馬 軍，王 健△

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州 450014；2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院，河南鄭州 450008；3鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，河南鄭州 450014)

我國是食管鱗癌高發(fā)區(qū)，約90%的食管癌為鱗狀細胞癌[1]，是第四大癌癥死亡原因。放療是食管癌的主要治療方法之一， DNA雙鍵斷裂(DSBs)是放療造成DNA損傷的主要類型。腫瘤細胞可通過同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)對DSBs進行修復(fù)[2]，降低放療敏感性。真核細胞中DSBs主要由NHEJ修復(fù)，DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)是NHEJ的中心因子，因此可通過抑制DNA-PKcs增加放療敏感性。NU7441是一種新型的DNA-PKcs抑制劑，可抑制DNA-PKcs磷酸化[3]，從而抑制DSBs修復(fù)[4-5]。自噬是保守的細胞內(nèi)過程。通過雙層膜囊泡即自噬體與溶酶體融合，實現(xiàn)蛋白質(zhì)和細胞器的降解。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能具有抗腫瘤和促進腫瘤發(fā)生的雙重作用[6-7]。藥物及放射照射可造成腫瘤細胞DNA損傷，并促進腫瘤細胞自噬現(xiàn)象，但自噬在DNA損傷、細胞死亡和增殖中的作用存在爭議[8-10]。本研究用X射線照射誘導(dǎo)EC109細胞DNA斷裂，用DNA-PKcs抑制劑NU7441抑制腫瘤細胞DSBs的自我修復(fù)過程，檢測自噬蛋白表達，探討阻斷食管鱗癌細胞DNA修復(fù)對其自噬過程的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 食管鱗癌細胞系EC109為鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化疾病研究所保存；RMPI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液購于上海生工公司；磷酸化DNA-PKcs(ab18192)購于英國Abcam；總DNA-PKcs(4602S)、Beclin-1(3495S)、LC3B(2775S)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(7074S)購于美國Cell Signaling Technology；凋亡檢測試劑盒購于美天旎公司(130-092-052)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和處理 EC109細胞用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。細胞生長至對數(shù)期時，加入NU7441(8 μmol/L)并進行X射線照射。前期預(yù)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同濃度伊立替康作用下，隨著NU7441濃度逐漸增大，對細胞的抑制率也逐漸增大，呈濃度依賴性， NU7441在8 μmol/L時抑制效應(yīng)最強，因此本研究中選8 μmol/L進行細胞處理。照射采用固定源皮距SSD照射，照射距離d為100 cm,照射劑量率600 MU/min,根據(jù)本課題組前期實驗結(jié)果[11],采用一次照射，劑量設(shè)為8 Gy(瑞典Elekta公司Synergy直線加速器)。實驗共分為4組(對照組、NU7441組、X-Ray組、X-Ray+NU7441組)，食管鱗癌EC109細胞經(jīng)過X射線照射和(或)NU7441處理24 h后，收集細胞進行下一步檢測。

1.2.2Western blot檢驗 冰上用蛋白裂解液處理細胞，超聲破碎，離心后取上清液，煮沸10 min后上樣。p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs用5%～16%梯度分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜12 h×250 mA。Beclin-1及LC3B用14%分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜2 h×250 mA。5% 牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉1 h。一抗4 ℃震蕩孵育過夜(p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs用1∶3 000，Beclin-1及LC3B用1∶1 000，β-actin為1∶5 000)。TBST洗膜3次后二抗孵育1 h。再次TBST洗膜3次，ECL染色，用FluorChem FC3成像儀采集圖像和灰度分析，β-actin作為內(nèi)參，計算相對表達量。

1.2.3凋亡檢測 用1×Binding Buffer對細胞進行清洗并重懸；加入Annexin V-FITC(10 μL/106細胞)，室溫避光孵育15 min；1×Binding Buffer對細胞進行清洗并重懸；加入碘化丙啶(PI，5 μL/106細胞)，上機檢測；記錄每組Annexin V-FITC陽性細胞所占百分比，分析實驗結(jié)果。

1.2.4四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖 以每孔5×103個細胞將EC109細胞接種至96孔板，過夜培養(yǎng)細胞貼壁后，分別對細胞進行照射和(或)NU7441處理，每組設(shè)置3個復(fù)孔；作用24 h后，用PBS對細胞進行清洗，每孔加入200 μL培養(yǎng)液和20 μL MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h；孵育結(jié)束后去除MTT，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床緩慢搖10 min后，在Multiskan MK3酶標(biāo)儀測定并記錄每孔波長490 nm處的吸光度(A)值。細胞存活率=(A490nm實驗組-A490nm空白組)/(A490nm對照組-A490nm空白組)。

2 結(jié) 果

2.1各組p-DNA-PKcs及t-DNA-PKcs的表達比較 對磷酸化和總DNA-PKcs的相對表達量進行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，NU7441組食管鱗癌細胞EC109中p-DNA-PKcs表達降低(P<0.01)，X-Ray組p-DNA-PKcs表達升高(P<0.01)；與對照組相比，NU7441組t-DNA-PKcs表達降低，X-Ray組t-DNA-PKcs表達升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

A:Western blot蛋白條帶；B：目的蛋白與β-actin灰度值比值柱形圖;a:P<0.05，與對照組比較

圖1各組p-DNA-PKcs及t-DNA-PKcs比較

A:Western blot蛋白條帶；B：目的蛋白與β-actin灰度值比值柱形圖;a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與X-Ray組比較

圖2各組Beclin-1及LC3B的表達比較

A:流式散點圖；B:細胞凋亡率柱狀圖；a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與X-Ray組比較

圖3不同處理組對食管鱗癌細胞EC109的細胞凋亡影響

2.2各組自噬蛋白Beclin-1及LC3B的表達比較 與對照組相比，X-Ray+NU7441組食管鱗癌細胞EC109中Beclin-1及LC3B表達升高(P<0.05)；與X-Ray組相比，X-Ray+NU7441組Beclin-1表達升高(P<0.05)，見圖2。

2.3細胞凋亡分析 與對照組相比，單獨NU7441組細胞凋亡率無明顯變化，X-Ray組及X-Ray+NU7441組凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與單獨NU7441組和X-Ray組相比，X-Ray+NU7441組細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，見圖3。

2.4MTT檢測細胞增殖情況比較 與對照組相比，單獨NU7441組細胞增殖無明顯變化，X-Ray組及X-Ray+NU7441組增殖明顯被抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與單獨X-Ray組相比，X-Ray+NU7441組細胞抑制率明顯增加(P<0.05)，見圖4。

a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與X-Ray組比較

圖4不同處理組對食管鱗癌EC109細胞增殖的影響

3 討 論

電離輻射可造成腫瘤細胞DSBs，腫瘤細胞可通過HR和NHEJ兩種機制進行修復(fù)[2]，這也是腫瘤細胞放療抵抗的重要機制之一。DNA-PKcs是NHEJ的重要成分[2]，其募集與磷酸化有助于腫瘤細胞通過NHEJ進行DNA斷裂的修復(fù)。另外在DSBs修復(fù)中DNA-PKcs也參與DSBs誘導(dǎo)的細胞凋亡[12]。通過抑制DNA-PKcs對DSBs的修復(fù)可導(dǎo)致細胞死亡。NU7441可抑制DNA-PKcs，從而抑制DSBs的修復(fù)[3-5]。前期本課題組分別用0～8 Gy作用于EC109、TE7和EC9706食管癌細胞系，結(jié)果表明在8 Gy時DNA-PKcs mRNA升高最明顯，因此將照射劑量定為8 Gy[11]。本研究中 Western blot結(jié)果顯示，X-Ray照射后食管鱗癌細胞EC109中p-DNA-PKcs表達升高；NU7441處理后，p-DNA-PKcs則表達降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。證實放射照射可誘導(dǎo)p-DNA-PKcs增多，且NU7441可有效抑制p-DNA-PKcs。t-DNA-PKcs也有類似的變化趨勢，但統(tǒng)計學(xué)分析無明顯差異，可能由于DNA-PKcs的功能主要依靠其磷酸化[3]，NU7441主要通過抑制DNA-PKcs磷酸化發(fā)揮作用。

放射照射可以促進自噬，同時也可誘導(dǎo)DSBs和繼發(fā)的修復(fù)反應(yīng)。以往研究均表明在DNA受損后，細胞自噬增多[8-9]。為進一步明確自噬與放射照射引起的DNA損傷間的關(guān)系，本研究用DNA-PKcs抑制劑NU7441抑制放射照射后EC109細胞DSBs修復(fù)，通過檢測自噬蛋白Beclin-1及LC3B表達水平，觀察EC109細胞自噬情況。結(jié)果顯示單獨放射照射或單獨應(yīng)用NU7441 EC109細胞自噬均增多；放射照射聯(lián)合NU7441作用EC109細胞后自噬明顯增多，表明放射照射、NU7441及放射照射聯(lián)合NU7441均可誘導(dǎo)細胞自噬增多。

自噬在細胞中的作用存在爭議，自噬既可誘導(dǎo)受損細胞死亡，也可對細胞起保護作用[13]。如自噬持續(xù)激活，細胞器和關(guān)鍵蛋白被耗盡，則導(dǎo)致一種特殊形式的細胞程序性死亡。但當(dāng)處于外界壓力下如營養(yǎng)缺乏時，自噬則為促進細胞存活的保護性機制。同樣，自噬對放射照射所引起的DNA損傷的作用亦存在爭議。研究表明放療過程中自噬增加或減少均可增強放療敏感性[13]，如放療聯(lián)合雷帕霉素、NU7441增加自噬；聯(lián)合3-methyladenine(3-MA)、baflomycin A1(Baf-A1)、Compound C減少自噬，均可增加放療敏感性促進細胞死亡[14-18]。但放療過程中NU7441增加自噬提高放療敏感性的結(jié)果是一致的，研究表明NU7441可提高結(jié)腸癌[4],乳腺癌[5]和前列腺癌[19]的放療敏感性，這也與本研究的實驗結(jié)果相符。細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，單獨放射照射、放射照射聯(lián)合NU7441均使細胞凋亡明顯增多；且放射照射聯(lián)合NU7441較單獨放射照射細胞凋亡增多更加明顯。MTT亦得到相似的結(jié)果。從而證實NU7441可增加EC109細胞放療敏感性，提高放療效率。

綜上所述，本研究證實NU7441可阻斷EC109細胞放射照射后DNA-PKcs修復(fù)通路，抑制DSBs的有效修復(fù)，并發(fā)現(xiàn)阻斷EC109細胞放射照射后DNA-PKcs修復(fù)通路可促進細胞自噬并抑制細胞增殖。

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