Map3k1基因下調對B6小鼠眼瞼角質形成細胞增殖和遷移能力的影響*

景 瑾，劉莉莉，尤 杰，夏婷婷，張 進，劉 春，朱順星△

(1.南通大學杏林學院，江蘇南通 226001；2.南通大學實驗動物中心，江蘇南通 226001)

研究表明眼瞼發育異常主要是由于眼瞼角質形成細胞遷移受阻所致[1]。大量資料顯示，Map3k1基因在小鼠眼瞼形態建成過程中起到關鍵作用。Map3k1是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成員，其表達的蛋白細胞外信號調節激酶1(MEKK1)具有廣泛的生物學功能。MEKK1蛋白是MAPK信號傳導通路的結點，可以調節JNK[2]、ERK1/2[3]、P38[4]、IKK-NFκB[5]等信號通路，這些信號通路參與調控相關細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等[2-5]，對細胞的生存、生長起著至關重要的作用。本研究擬采用RNA干擾技術，實現對Map3k1的特異性沉默，來檢測其對B6小鼠眼瞼角質形成細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 B6(C57BL/6，B6)小鼠購自南通大學實驗動物中心，飼養在清潔級屏障動物房內， 室內溫度為(23±2)℃， 濕度控制為(55±5)%，自由采食和飲水，室內照明采用12 h∶12 h 明暗交替，定期更換籠具、墊料。

1.1.2主要儀器及試劑 CO2細胞培養箱購自Thermo公司(美國)；倒置相差顯微鏡購自Leica公司(德國)；抗菌藥物、大豆胰蛋白酶抑制劑購自Amresco公司(美國)；角質形成細胞無血清培養基(DK-SFM)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)購自Gibco公司(美國)；中性蛋白酶Ⅱ購自Roche公司(瑞士)；24孔細胞培養板購自Corning公司(美國)；質粒抽提試劑盒購自Omega公司(美國)；Mouse monoclonal to MEKK1購自Abcam公司(英國)；Anti-Mouse IgG、HRP-linked Antibody購自Cell Signaling公司(美國)。

1.2方法

1.2.1B6小鼠眼瞼角質形成細胞的分離和原代培養 取1 d B6小鼠，超凈臺中取眼瞼，在75%乙醇中清洗，然后在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗；將眼瞼放入添加有中性蛋白酶Ⅱ(3 mg/mL)和抗菌藥物的DK-SFM 培養液中，4 ℃消化18 h；加入等體積的PBS，分離真皮和表皮，將表皮充分剪碎，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 ℃消化約10 min；再加入大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化，1 200 r/min 室溫離心5 min，棄上清液，PBS清洗一遍，加入含有10 ng/mL表皮生長因子(EGF)的DK-SFM 培養液重懸細胞；調整細胞密度為2×105個/mL；將細胞接種于12孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養；24 h后更換培養液，每隔1 d換液1次。

1.2.2靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表達載體 本課題組在前期實驗中已成功構建靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表達載體，并篩選出干擾效率最高的質粒[6]。Map3k1基因序列的miRNA靶向序列如下，miRNA3-F:5′-TGC TGA TCC ATC TCC TTT AAT AGG GAG TTT TGG CCA CTG ACT GAC TCC CTA TTA GGA GAT GGA T-3′;miRNA3-R:5′-CCT GAT CCA TCT CCT AAT AGG GAG TCA GTC AGT GGC CAA AAC TCC CTA TTA AAG GAG ATG GAT C-3。

1.2.3菌種復性與質粒抽提 -80 ℃冰箱中取出之前所保存的菌種，冰上溶解；吸取50 μL于1 mL LB液體培養基(含Amp+)中，37 ℃、220 r/min培養1 h；菌種狀態良好時，直接以劃線法涂LB平板[含氨芐青霉素(Amp+)]，倒扣平板，37 ℃培養過夜；用10 μL槍頭挑取平板上單克隆菌落至5 mL LB液體培養基(含Amp+)中，37 ℃、220 r/min搖床培養過夜，1 mL保種，1 mL送上海生工生物工程股份有限公司進行測序；測序正確的再次搖菌，按試劑盒說明書提取質粒，獲得的質粒，核酸蛋白定量儀測濃度，-20 ℃存儲備用；分裝部分抽提的質粒DNA，送上海生工生物工程股份有限公司進行測序分析。

1.2.4Map3k1 amiRNA-3質粒轉染B6小鼠眼瞼角質形成細胞 取2 μL Map3k1 amiRNA-3質粒(568 ng/μL)溶于100 μL Opti-MEM基培中，取2 μL Lipofectamin 2000溶于100 μL Opti-MEM基培中，分別輕輕混勻，室溫各孵育5 min；將兩個混合液輕輕混勻，室溫孵育20 min；角質形成細胞換液，更換DK-SFM 培養液800 μL；混合液加入12孔板中，輕輕混勻，細胞于37 ℃，5% CO2培養箱中培養6 h后更換DK-SFM 培養液。細胞轉染后24、48、72 h分別提取總RNA和總蛋白。

1.2.5Real-Time PCR檢測Map3k1 mRNA相對表達量 根據實驗時間點要求提取細胞總RNA，采用TRIzol法提取。使用逆轉錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司)進行逆轉錄反應。根據Map3k1基因mRNA設計RT-PCR反應引物如下，GAPDH-F:5′-GGA GCG AGA CCC CAC TAA C-3′,GAPDH-R:5′-GGC GGA GAT GAT GAC CCT-3′;Map3k1-F:5′-GGT CCT AAG AGG TCA GCA GTA TG-3′,Map3k1-R:5′- GGA CAG GTG TGA CGG GAT G-3′。RT-PCR反應采用SYBR Green MiX試劑，反應體系如下：SYBR Green mix 10 μL、 Primer-F(10 pmol)0.5 μL 、Primer-R(10 pmol)0.5 μL 、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL。RT-PCR反應條件為：95 ℃，5 min；45個循環(95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s)，每個循環在延伸階段收集熒光；產物熔解曲線分析：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。各組細胞目的基因均以內參基因GAPDH進行校正，為了減少誤差，實驗重復3批樣本，每個樣本均重復3次，使用2-ΔΔCT法進行相對定量分析。

1.2.6Western blot檢測Map3k1蛋白相對表達量 根據實驗時間點要求提取各組細胞總蛋白；并取適量以BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；按說明書配制分離膠及濃縮膠：Gapdh配制12%的分離膠，Map3k1配制6%的分離膠；常規程序電泳，直至目的蛋白充分跑開；電泳結束后，Gapdh以300 mA，60 min的條件轉膜，Map3k1以110 V，120 min的條件轉膜；轉膜結束后將膜取出，置于封閉液中室溫封閉2 h；在膜上滴加適量1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌1次，TBS洗滌2次；加二抗室溫孵育2 h；再用TBST洗滌1次，TBS洗滌2次，取1 mL ECL顯色液顯色1 min。

1.2.7四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測B6小鼠眼瞼角質形成細胞的增殖水平 取對數生長期細胞，胰酶消化后離心收集，加入DK-SFM 培養液重懸細胞，細胞計數調整為 2×104/mL。將制備好的細胞懸液邊輕輕混勻邊加入96 孔板，每孔加入 100 μL；將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養過夜，第2天做轉染，分為Ctrl Map3k1組與Map3k1 amiRNA-3組，Ctrl Map3k1組只加入培養基不加細胞，每組設5個復孔取均值，實驗重復 3 次。在轉染24、48、72 h后MTT法測細胞活力；不同時間Map3k1 amiRNA-3組及Ctrl Map3k1組每孔加入10 μL MTT 溶液，繼續培養 4 h；再加入 100 μL Formanzan溶解液，培養箱繼續孵育約4 h，顯微鏡下觀察待結晶物充分溶解后，在酶標儀吸光度(A)570 nm處測量各孔的A值。

1.2.8劃痕實驗檢測B6小鼠眼瞼角質形成細胞的遷移能力 取對數生長期細胞接種到24孔板，每孔接種1×106個細胞，并設3個重復；Map3k1 amiRNA-3組與Ctrl Map3k1組于轉染36 h后，棄原培養液，加入含有10 μg/mL 絲裂霉素C的DK-SFM培養液培養12 h；然后用100 μL的槍頭在每個孔的中央進行十字劃痕；吸去培養液，0.01 mol/L PBS 輕洗；加入含有10 ng/mL EGF的DK-SFM 培養液，于十字劃痕處顯微鏡觀察拍照，記為0 h，每孔照數個不同的位置；培養24 h 后，依據記錄的大致位置再次拍照。

2 結 果

2.1Map3k1 amiRNA-3干擾質粒 測序結果與預期完全吻合(圖1)，miRNA序列正確插入pcDNA-miRNA載體中。

2.2Map3k1 amiRNA-3質粒對Map3k1基因的干擾效率 Real-time PCR結果(圖2A)表明在轉染Map3k1 amiR-3質粒后48 h，B6小鼠眼瞼角質形成細胞Map3k1基因mRNA的表達量下降最為顯著，干擾效率高達70%(P<0.01)；Western blot結果(圖2B、C)表明在轉染Map3k1 amiR-3質粒后72 h，B6小鼠眼瞼角質形成細胞Map3k1基因蛋白的表達量下降最為顯著，干擾效率高達70%(P<0.05)。

A:Real-Time PCR檢測Map3k1 mRNA相對表達量；B：Western blot檢測Map3k1 amiRNA-3蛋白的相對表達量；C：Map3k1 amiRNA-3蛋白的相對表達量；a：P<0.05，b：P<0.01

圖2 Real-Time PCR、Western blot檢測Map3k1 amiRNA-3的干擾效率

2.3MTT法檢測B6小鼠眼瞼角質形成細胞的增殖水平 細胞增殖水平檢測結果顯示：Map3k1 amiRNA-3組在轉染24、48、72 h細胞增殖水平顯著低于Ctrl amiRNA組(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 MTT法不同時間細胞增殖水平檢測

a：P<0.05，b：P<0.01，與Ctrl amiRNA組比較

2.4劃痕實驗檢測B6小鼠眼瞼角質形成細胞的遷移能力 Map3k1 amiRNA-3組角質形成細胞，在劃痕后24 h，其穿過劃痕區的細胞數量與相對距離均明顯低于轉染空載體的Ctrl amiRNA組(圖4)，定量分析發現Ctrl amiRNA組遷移的細胞數為(615±39)個，Map3k1 amiRNA-3組僅有(325±34)個，差異有統計學意義(P<0.05)；細胞遷移劃痕區的相對距離，Ctrl amiRNA組為(0.339±0.015)，MAp3k1 amiRNA-3組為(0.181±0.027)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 劃痕實驗檢測B6小鼠眼瞼角質形成細胞的遷移能力

3 討 論

眼瞼是眼球前的軟組織，當眼受到外界各種刺激時，可通過中樞神經的指揮及時將其關閉，從而阻擋外來異物或強光對眼睛造成傷害，對眼的發育和保護具有重要作用。若眼瞼發育異常便會受到各種眼部疾病的困擾，如角膜病、白內障、視力減退等。研究表明眼瞼發育異常主要是由于眼瞼角質形成細胞遷移受阻所致[1]。有研究發現通過MEKK1的轉導，可以引發角質形成細胞的遷移，MEKK1對角質形成細胞的運動有著至關重要的作用[7]。

RNA干擾是由雙鏈RNA(dsRNA)誘發同源mRNA高效且特異性降解的現象，可以特異性剔除或關閉目的基因的表達，該技術具有成本低廉、高效率、高特異性、操作方便等優勢[8-10]，已成為各大實驗室探索基因功能的常用技術。

Map3k1基因位于5q11.2，其編碼的蛋白稱為MEKK1，全長196×103。MEKK1是MAPK家族中的重要成員，具有Ser/Thr激酶活性，其C-端為催化結構域，N-端為調節結構域，可以磷酸化與其結合的下游靶蛋白，從而介導蛋白間的相互作用并影響其行為和生物學功能。MEKK1蛋白是MAPK信號傳導通路的結點，可以調節JNK[2]、ERK1/2[3]、P38[4]、IKK-NFκB[5]等信號通路，這些信號通路參與調控相關細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等[2-5]。Map3k1對細胞的發生、發展起著至關重要的作用，有研究表明Map3k1具有可決定細胞命運的開關樣功能，即促進和抑制細胞凋亡的雙重作用[11]。而MEKK1 作為幾個 MAPK 通路的上游調節因子，亦涉及不同種類和細胞類型的生物學反應，包括角質形成細胞的分化、T細胞活化和壓力刺激誘導的細胞凋亡等。因而，本研究擬采用RNA干擾技術，實現對Map3k1的特異性沉默，來檢測其對B6小鼠眼瞼角質形成細胞生物學功能的影響。期許為更好的理解、掌握Map3k1在B6小鼠眼瞼角質形成細胞中的作用，及其在眼瞼發育過程中的作用提供理論依據。

首先通過前期實驗中已成功構建靶向沉默Map3k1基因的amiRNA表達載體[6]，實現對Map3k1的特異性沉默，干擾效率高達70%，為研究B6小鼠眼瞼角質形成細胞生物學效應在干擾Map3k1前后的變化奠定了基礎。

Map3k1基因參與調節各種類型的細胞運動遷移，研究發現Map3k1基因敲除的新生鼠由于上皮細胞遷移缺陷，導致出生時眼瞼不能閉合[12]，說明Map3k1基因在小鼠眼瞼形態建成過程中起到關鍵作用。Map3k1表達的缺乏可減少細胞的遷移和侵襲能力[13]。在本實驗中發現靶向抑制Map3k1的表達后，B6小鼠眼瞼角質形成細胞的遷移能力被顯著抑制，無論是遷移的距離還是遷移的細胞數量都顯著下調(P<0.05)。此外，還發現Map3k1的表達被抑制后，會影響B6小鼠眼瞼角質形成細胞的增殖能力(P<0.05)。這些結果表明靶向抑制Map3k1的表達能夠廣泛的影響B6小鼠眼瞼角質形成細胞的生物學行為，從而影響眼瞼的發育。

[1]KATO S,MOHRI Y,MATSUO T,et al.Eye-open at birth phenotype with reduced keratinocyte motility in LGR4 null mice[J].FEBS Lett,2007,581(24):4685-4690.

[2]LU H J,NING X J,TAO X E,et al.MEKK1 associated with neuronal apoptosis following intracerebral hemorrhage[J].Neurochem Res,2016,41(12):3308-3321.

[3]CHENG Y,LIN C H,CHEN J Y,et al.Induction of connective tissue growth factor expression by hypoxia in human lung fibroblasts via the MEKK1/MEK1/ERK1/GLI-1/GLI-2 and AP-1 pathways[J].PLoS One,2016,11(8):1-23.

[4]HUANG D S,LI X J,SUN L,et al.Regulation of hippo signalling by p38 signalling[J].J Mol Cell Biol,2016,8(4):328-337.

[5]AL-SADI R,GUO S H,YE D M,et al.TNF-alpha modulation of intestinal tight junction permeability is mediated by NIK/IKK-alpha axis activation of the canonical NF-kappa B pathway[J].Am J Pathol,2016,186(5):1151-1165.

[6]王勝潔，劉春，汪海峰，等.靶向抑制MAP3K1對小鼠乳腺癌細胞生物學行為的影響[J].黑龍江畜牧獸醫，2016,290:26-31.

[7]XIA Y,KAO W W.The signaling pathways in tissue morphogenesis:a lesson from mice with eye-open at birth phenotype[J].Biochem Pharmacol,2004,68(6):997-1001.

[8]SUGAHARA R,TANAKA S,JOURAKU A,et al.Geographic variation in RNAi sensitivity in the migratory locust[J].Gene,2017,605:5-11.

[9]KAMATH R S,FRASER A G,DONG Y,et al.Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi[J].Nature,2003,421(6920):231-237.

[10]VOLPE T,KIDNER C,HALL I M,et al.Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi[J].Science,2002,297(5588):1833-1837.

[11]ZEBROWSKI D C,ALCENDOR R R,KIRSHENBAUM L A,et al.Caspase-3 mediated cleavage of MEKK1 promotes p53 transcriptional activity[J].J Mol Cell Cardiol,2006,40(5):605-618.

[12]YUJIRI T,WARE M,WIDMANN C,et al.MEK kinase 1 gene disruption alters cell migration and c-Jun NH2-terminal kinase regulation but does not cause a measurable defect in NF-kappa B activation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000;97:7272-7277.

[13]STEED E,ELBEDIWY A,VACCA B,et al.MarvelD3 couples tight junctions to the MEKK1-JNK pathway to regulate cell behavior and survival[J].J Cell Biol,2014,204(5):821-838.