MiR-650通過靶向ING4促進骨肉瘤細胞增殖的研究*

陳賢明，張 森，王愛民，王子明

(陸軍軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所骨科，重慶 400042)

骨肉瘤是兒童和青年人群中最常見的原發性骨腫瘤，占原發性骨腫瘤的20%[1-2]。遺傳學的改變與骨肉瘤的發生發展有著緊密的聯系，因此尋找一個重要的基因治療靶標成為了人們關注的重點。微小RNA(miRNA)是一類小非編碼RNA分子，大量的研究已經證實miRNA參與了多種生物學進程，包括細胞增殖、分化、凋亡等[3-4]。近年有研究發現，miR-650在包括胃癌、肝癌、肺腺癌等多種腫瘤組織中都有著高表達，并且參與了細胞的異常增殖[5-9]，提示其可能是一種潛在的促癌因子。本研究用實時熒光定量PCR的方法檢測了骨肉瘤患者組織及人骨肉瘤細胞系中miR-650的表達情況，同時檢測在抑制miR-650后人骨肉瘤細胞增殖情況的變化并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1主要材料 骨肉瘤組織及癌旁正常組織收自本科室治療患者，共計4例：1號病例為男性，19歲，發病于右側股骨遠端，大小約7 cm×9 cm，ⅠB期，為軟骨母細胞型骨肉瘤；2號病例為男性，17歲，發病于左側股骨遠端，大小約2 cm×2 cm，ⅠA期，為骨母細胞型骨肉瘤；3號病例為女性，14歲，發病于左腓骨小頭，大小約3 cm×5 cm，ⅡA期，為骨母細胞型骨肉瘤；4號病例為女性，21歲，發病于右側股骨遠端，大小約3 cm×6 cm，ⅠB期，為纖維母細胞型骨肉瘤。樣本搜集在經醫院倫理委員會審查通過，患者簽署知情同意書后進行。人骨肉瘤細胞系MG63及健康人成骨細胞系hFOB1.19購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，RPMI 1640培養基(Gibico,美國)、轉染用培養基OPTI MEMI(Gibico,美國)、胎牛血清(Gibico,美國)、Lipofectamine 2000 轉染試劑(Invitrogen,美國)、細胞培養箱(Thermo,美國)、TRIzol(Invitrgen,美國)、RIPA裂解液(碧云天，江蘇)、TRIzol試劑(Invitrogen,美國)、四甲基偶氮唑鹽(MTT,Sigma,美國)、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(天根公司，北京)、抗體(Santa cruz,美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 MG63細胞及hFOB1.19均用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基進行培養，培養條件為37 ℃、含5% CO2氣體、濕度飽和的培養箱中。2～3 d換液1次。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2MiR-650抑制劑及ING4 siRNA轉染 采用Lipofectamine 2000試劑對MG63細胞進行轉染，在轉染24 h后用qPCR的方法檢測MG63細胞中miR-650的表達情況。將處于對數生長期的細胞接種到6孔板中，設置陰性對照組(NC)、亂序組及miR-650抑制劑組。轉染步驟根據Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行。轉染后24 h通過qPCR進行驗證轉染效率。MiR-650抑制劑及ING4 siRNA購自銳博生物科技有限公司(廣州)，miR-650抑制劑序列為5′-GTC CTG AGA GCG CTG CCT CCT-3′，ING siRNA序列為5′-GCC ACT GAG TAT ATG AGT A-3′。

1.2.3RNA提取與實時熒光定量PCR分析 收集了4例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織及癌旁正常組織，并用qPCR的方法測定了4對組織的miR-650表達情況。同時對比了健康人成骨細胞系(hFOB 1.19)及人骨肉瘤細胞系(MG63)中miR-650的表達情況。按照TRIzol試劑說明書，提取細胞總RNA。測定A260 nm/A280 nm，以檢測總RNA的濃度及純度。根據逆轉錄試劑盒說明書的步驟將RNA逆轉錄為cDNA。用q-PCR的方法檢測miR-650及ING4水平。其中miRNA-650的上游引物為：5′-AGA GGA GGC AGC GCT CT-3′，下游引物為：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；內參U6的上游引物為：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；ING4的上游引物為：5′-TTT CAG AGG GAG GGT CCT TT-3′，下游引物為：5′-GCC AGA GCC TAG ATG ACC TG-3′；β-actin的上游引物為：5′-AAA GAC CTG TAC GCC AAC AC-3′，下游引物為：5′-GTC ATA CTC CTG CTT GCT GAT-3′。反應條件如下：95 ℃預變性5 min；隨后95 ℃ 15 s變性，59 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸及檢測。通過Ct值及計算2-ΔΔCt得到其相對表達量。

1.2.4細胞增殖實驗 將MG63細胞以每孔5×103個細胞的數量接種于96孔板中，在指定的時間點加入20 μL無菌MTT染料(5 mg/mL,Sigma，美國)，于37 ℃中孵育4 h，隨后移除培養基，加入150 μL二甲基亞砜，并在室溫搖床上搖10 min。測量490 nm波長的A。

1.2.5Western blot檢測ING4蛋白的表達 用RIPA裂解液對細胞進行裂解，刮取細胞懸液用超聲處理10～15 s，在冰上裂解1 h后，12 000×g離心30 min，收集上清液。用BCA法對蛋白濃度進行測定，隨后在蛋白樣本中加入上樣緩沖液，于沸水中煮5 min，-20 ℃保存。在Western blot實驗中，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白樣品進行分離后，將蛋白用半干轉膜的方法將蛋白轉移到NC膜上。用5%的脫脂奶粉進行封閉。隨后加入1∶200比例稀釋的ING4一抗(Santa cruz)，4 ℃過夜。用TBST清洗膜3次后，用相應的熒光二抗孵育1 h。隨后用Odyssey激光成像系統(LI-COR,Lincoln,美國)進行掃膜成像。結果用ING4/GAPDH的比值來表示。

2 結 果

2.1miR-650在骨肉瘤細胞系中表達升高 在骨肉瘤組織中的miR-650表達量顯著高于癌旁正常組織，見圖1；同時MG63細胞中miR-650的表達也顯著高于hFOB 1.19細胞(1.00±0.17vs. 4.27±0.23)，差異有統計學意義(P<0.05)。

1：1號病例；2：2號病例；3：3號病例；4：4號病例；a:P<0.05

圖1患者的骨肉瘤組織和癌旁組織中miR-650的表達情況

2.2miR-650抑制劑對miR-650表達的抑制效率 miR-650抑制劑組miR-650的表達量為0.32±0.14，較陰性對照組(1.00±0.15)、亂序組(1.02±0.1)顯著降低且差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3抑制miR-650后，MG63細胞增殖顯著減弱 相對于亂序組和對照組，抑制miR-650后在48、72、96 h時，MG63細胞的增殖能力均顯著受到抑制，且差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05,與亂序組比較

圖2抑制miR-650后MG63細胞的增殖情況

2.4抑制miR-650后ING4 mRNA及蛋白表達顯著升高 相對于對照組和亂序組，在miR-650抑制劑組，ING4的mRNA水平和蛋白表達水平均顯著升高(mRNA表達分別為1.00±0.16、1.08±0.14、5.35±0.32；蛋白表達分別為0.62±0.06、0.59±0.12、2.45±0.20)，見圖3。

A:抑制miR-650后ING4的mRNA表達情況；B：抑制miR-650后ING4的蛋白表達情況；a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05,與亂序組比較

圖3抑制miR-650后ING4的mRNA及蛋白表達情況

2.5siRNA干擾ING4 mRNA表達后，抑制miR-650后對MG63細胞增殖的抑制作用 在干擾ING4后，ING4的mRNA水平顯著降低；而在干擾掉ING4后，抑制miR-650降低MG63增殖的作用顯著減弱，且在72 h及96 h處差異有統計學意義(P<0.05) ，見圖4。

a：P<0.05，與miR-650抑制劑組比較

圖4 miR-650抑制細胞增殖的能力比較

3 討 論

大量的研究已經證實，miRNA在腫瘤組織中的表達譜與對應正常組織有著顯著的差異，并且這種差異與腫瘤的發生、發展密切相關[10-12]。miR-650 在多種腫瘤組織中都有著高表達，提示其可能是潛在的促癌因子。ZENG等[13]和ZHANG等[4]分別發現miR-650促肝癌及胃癌形成的作用與其靶向ING4有關。為了研究miR-650在骨肉瘤中是否也發揮同樣的促進腫瘤細胞生成的作用，本研究對其在骨肉瘤細胞系MG63細胞的增殖情況進行了研究。在本研究中，證實了miR-650在骨肉瘤細胞系中表達較正常成骨細胞中升高，提示miR-650與骨肉瘤有著密切的聯系。而隨后的研究中發現抑制miR-650后可以顯著降低MG63細胞的增殖，說明miR-650可能參與了骨肉瘤的發生及腫瘤組織的快速增殖。

miR-650參與了MG63細胞增殖的調節，是通過什么機制完成的呢？有研究認為miR-650可以通過抑制包括肝癌及胃癌等腫瘤細胞中的ING4發揮促腫瘤形成的作用。ING4是一種新的腫瘤抑制基因家族的一員，近年來有多項研究證實ING4在人骨肉瘤的發病過程中扮演了重要的作用。研究發現ING4能與p53相互作用并增強其功能。而p53是一種已經被廣泛研究的抑癌基因，它可以通過調節細胞凋亡防止癌變，同時協助修復受損DNA，所以增強p53功能對腫瘤抑制有著重要的意義。此外， ING4還能直接阻斷NF-κB信號通路，從另一個途徑抑制腫瘤的生成與侵襲。ING4可能通過多個通路對腫瘤的發生及轉移發揮抑制作用，因此也成了抑制腫瘤的熱門靶點。miR-650已經在多項研究中證實可以調節ING4的表達，但在骨肉瘤細胞中尚未有研究，因此，為了探索miR-650促進MG63細胞促癌作用是否與ING4有關，本研究檢測了在抑制miR-650后ING4的mRNA和蛋白的表達情況。結果證實抑制miR-650后，MG63細胞中ING4的mRNA和蛋白的表達水平都顯著升高，提示miR-650可以在轉錄和翻譯水平降低ING4的表達。ING4是否是介導了miR-650調節MG63細胞增殖？為了證實這個問題，本研究用siRNA抑制了ING4的表達，隨后觀察了miR-650抑制劑對MG63細胞增殖的抑制作用。結果發現抑制ING4表達后，miR-650抑制劑對MG63細胞增殖的抑制作用顯著減弱，提示ING4在miR-650對MG63細胞增殖的調節中發揮著重要的作用。本研究結果提示miR-650可能通過ING4調節骨肉瘤細胞的增殖，為骨肉瘤的治療提供了新的靶點和思路。

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