槲皮素對人肝星狀細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響與其細胞周期研究

蔣 煒，鄧治林，李福昌

(四川省簡陽市中醫醫院外科 641400)

肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)，也稱肝貯脂細胞(fat-storing cell，FSC)，主要分布于肝竇周隙。目前認為，FSC可以合成和分泌膠原蛋白及產生細胞外基質，在肝纖維化、肝硬化發展過程中起著主要作用[1-3]。槲皮素(quercetin)屬黃酮類化合物，存在于許多植物的花、葉、果實中，如洋蔥、蘋果、綠茶、蘆丁、連翹及抗肝病植物藥趕黃草等植物中含量較高。目前認為，槲皮素具有較好的祛痰、止咳、平喘、抗腫瘤等作用[4-5]。本研究通過用體外培養人HSC的方法為基礎，用槲皮素進行干擾，檢測槲皮素對HSC細胞周期的影響，以及對其Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，分析HSC參與肝纖維化的機制及槲皮素的意義，為星狀細胞的功能調控、調控機制的研究，及肝纖維化、肝硬化的防治研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞來源及主要試劑 人HSC株：廣州市十環醫藥科技有限公司；槲皮素：美國Sigma公司，批號PHR1488，相對分子質量302.24；量子點標記試劑盒：武漢珈源量子點技術開發有限責任公司；免疫組織化學試劑盒：北京博奧森生物技術有限公司；BX51熒光顯微鏡：日本奧林巴斯(Olympus)公司；Leica-DM6000光學顯微鏡Leica-DFC295系統：徠卡(Leica)儀器(德國)有限公司；BD FACSCalibur流式細胞儀：美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組干擾 將購買的細胞株(廣州市十環醫藥科技有限公司)復蘇，制成細胞懸液，細胞濃度約1.0×108/L，接種于24孔培養板(鋪墊圓形蓋玻片)。培養條件為：37 ℃、10%小牛血清、DMEM培養基、5% CO2。取培養第4天作后續實驗。培養細胞分為對照組和實驗組。槲皮素以二甲基亞砜為溶劑溶解稀釋，分別給予0 μmol/L(對照組)、50 μmol/L(50-實驗組)、100 μmol/L(100-實驗組)、500 μmol/L(500-實驗組)干擾，48 h后終止干擾。取出蓋玻片，4%甲醛固定30 min，進入后續實驗。

1.2.2染色及檢測 (1)HE染色：取出細胞爬片，蘇木精染色，鹽酸乙醇分色，氨水返藍，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。采用盲法將細胞核體積由大至小分為3類進行半定量計數。(2)免疫組織化學染色(SABC法)：細胞爬后片PBS沖洗，0.1% Triton-X 100處理，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，滴加1∶100稀釋的一抗孵育過夜，PBS洗滌，二抗孵育，PBS洗滌，SABC酶標，DAB(棕色)顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。(3)量子點標記[6-8]：細胞爬片后0.1% Triton-X 100通透處理，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，滴加1∶100稀釋的Ⅰ膠原蛋白一抗(鼠抗鼠)37 ℃ 4 h，滴加1∶100稀釋的Ⅲ膠原蛋白一抗(兔抗鼠)37 ℃ 4 h，PBS洗滌，量子點標記二抗(抗鼠、抗兔)復合物37 ℃孵育20 min，PBS洗滌，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察成像并照相，記錄觀察結果。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期 0.25%胰蛋白酶消化細胞成細胞懸液，離心，冰乙醇固定。離心，調整細胞濃度為5×105/mL，加入碘化丙啶(PI)染液，孵育。以488 nm氬離子激光激發，應用BD CSCalibur(美國 BD公司)流式細胞儀FACStation、CellQUEST Pro數據處理軟件進行細胞周期檢測和分析。

2 結 果

2.1細胞形態學 普通光學顯微鏡觀察培養HSC，各樣本均表現為細胞密度及細胞形態無明顯的差異。細胞貼壁生長，有突起，細胞直徑約25～35 μm。核位于中央，體積大，嗜堿性；細胞質呈弱嗜堿性，細胞質內可見大量細小嗜堿性細小顆粒(圖1)。槲皮素干擾48 h，細胞核大小不均勻，細胞核越小，嗜堿性越強。HSC經HE染色細胞核計數4組之間差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 肝星狀細胞HE染色細胞核計數(n=100)

2.2免疫組織化學結果 各組均可見大量HSC，細胞內均有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性產物，分布在細胞質內，呈棕黃色顆粒(圖1)。圖像分析吸光度值和陽性面積比值(PN-area)結果所示，與對照組比較，實驗組Ⅰ型膠原蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Ⅲ型膠原蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

圖1 HE染色、免疫組織化學染色HSC(×200) 表2 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白免疫組織化學染色吸光度與PN-area比較

組別nⅠ型膠原吸光度PN-areaⅢ型膠原吸光度PN-area對照組240.135±0.00427.36±6.470.216±0.11822.15±4.2750-實驗組240.117±0.003a18.29±2.34a0.209±0.09821.69±2.48100-實驗組240.112±0.004a15.48±2.51a0.221±0.12420.46±3.52500-實驗組240.097±0.003a14.69±1.22a0.224±0.04122.36±4.42

a：P<0.05，與對照組比較

圖2 免疫熒光染色結果(×200)

2.3免疫熒光結果 干擾48 h后，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白經雙標顯示，對照組和各實驗組Ⅰ膠原蛋白陽性產物顯示為綠色熒光，Ⅲ膠原蛋白陽性產物顯示為紅色熒光(圖2)。顯微鏡熒光強度定量分析結果顯示，實驗組Ⅰ型膠原蛋白表達明顯降低，與對照組之間差異有統計學意義(P<0.05)；Ⅲ型膠原蛋白表達無明顯變化，與對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白免疫染色熒光強度

a：P<0.05，與對照組比較

2.4肝星狀細胞流式細胞儀細胞周期檢測結果 干擾48 h后，對照組和實驗組G1期細胞比例比較，差異有統計學意義(P<0.05)；S期細胞比例，G2期細胞比例各組之間比較，無明顯變化規律(圖3，表4)。

A:對照組；B：50-實驗組；C：100-實驗組；D：500-實驗組

圖3 肝星狀細胞流式細胞儀細胞周期檢測結果表4 流式細胞儀細胞周期檢測結果(%)

a：P<0.05，與對照組比較

3 討 論

肝臟疾病是目前威脅人類健康的一個巨大問題。臨床上在各種慢性病致病因子的作用下，肝內纖維成分異常增生，膠原纖維過度沉淀，引起肝纖維化，繼續發展則成為肝硬化。文獻報道表明，HSC具有產生細胞外基質及纖維的能力，因此認為，HSC與肝纖維化及肝硬化直接相關[9-11]。本研究采用現有的HSC株培養技術，用臨床上使用極為廣泛的趕黃草等中藥的提純品槲皮素對細胞進行干擾，在體外實驗對HSC的形態結構及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的合成功能進行初步研究。由于HSC固有的生物特性，其Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白基因會表達而產生膠原纖維的主要構成成分：Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白。通過檢測培養HSC形態結構、細胞周期及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，反應HSC的功能狀態和產生膠原纖維的能力，為肝纖維化、肝硬化的基礎研究奠定實驗基礎。

實驗結果顯示，體外肝星狀細胞呈貼壁生長，有多個突起，細胞質內可見大量嗜堿性細小顆粒。細胞核體積統計結果顯示，槲皮素干擾后，大細胞核的細胞比例減少，小細胞核的細胞比例增高。細胞核大小及嗜堿性可以一定程度反應細胞的功能狀態，一般細胞核體積越小，嗜堿性越強，說明細胞的活性程度越低，功能相對靜止，反之亦然。結果說明，槲皮素對肝星狀細胞的活性有抑制作用。

免疫組織化學及免疫熒光檢測顯示，肝星狀細胞在常規培養下細胞內均有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性產物，陽性產物分布在細胞胞質內，免疫組織化學切片中表現出呈棕黃色顆粒。熒光顯微鏡下，免疫產物呈現熒光，通過采用不同種屬一抗分別標記，在同樣的細胞內Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白呈現出不同的綠色熒光和紅色熒光。用中藥有效成分提純品槲皮素進行培養干擾后，細胞內仍然有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達，但Ⅰ型膠原蛋白表達強度明顯降低，Ⅲ型膠原表達強度未見明顯改變。說明槲皮素對體外培養HSC Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白具有調節作用。

有研究也證實，血清Ⅲ型膠原蛋白濃度與肝炎癥、壞死和肝纖維化有關，但以肝纖維化相關為主，肝硬化患者明顯升高，但肝硬化晚期，Ⅲ型膠原蛋白反而低于早期[12-13]。膠原纖維中以Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白為主，在炎癥及損傷修復過程中，伴隨著舊膠原的降解和新膠原的產生、重新排列沉積。在胚胎皮膚損傷修復中有無瘢痕愈合現象[14]，無瘢痕愈合以Ⅲ型膠原蛋白為主，無瘢痕愈合可能與細胞外基質的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白比例有直接關系，即：Ⅲ型膠原蛋白濃度高相對Ⅰ型膠原蛋白濃度高更容易降解，相對更不容易形成瘢痕組織及膠原纖維沉積。在肝纖維化及肝硬化的發展中，其實本質就是炎癥導致肝細胞損傷，HSC受刺激產生膠原纖維，膠原纖維不能充分降解，從而導致膠原纖維沉積的過程。本實驗結果顯示，槲皮素可以降低Ⅰ型膠原蛋白的產生，說明其可以抑制星狀細胞產生膠原纖維沉積；另外，槲皮素對Ⅲ型膠原蛋白表達強度未見明顯影響，說明槲皮素可以降低Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白的比例，可以使其產生的膠原更容易降解，可能是趕黃草等中藥可以抑制肝纖維化、肝硬化的發展速度、甚至緩解肝纖維化及肝硬化的主要機制。

流式細胞儀是檢測細胞周期的經典方法。實驗中，肝星狀細胞保持不斷增殖狀態，細胞總是處于從G1、S、G2和M期的連續的細胞周期中。在細胞周期的各階段，細胞分別進行著DNA復制、蛋白質合成及細胞分裂等重要的生理活動[12，15]。實驗結果顯示，槲皮素有明顯升高G1期星狀細胞比例的作用，對照組和實驗組G1期細胞比例比較有明顯差異，而S期、G2期細胞比例無明顯影響。其結果說明，槲皮素對星狀細胞的增殖具有抑制作用，在細胞周期中，其抑制作用的時間點G1期。其G1比例增高，則說明細胞在G1停留時間延長、細胞向G0發展的可能性增大、細胞出現功能相對停滯的可能性增大，則出現而不被活化的可能性增大，這可能是趕黃草等含槲皮素的中藥可以抑制肝纖維化、肝硬化的發展的作用機制之一[16]。

綜上所述槲皮素對體外培養HSC有明顯調控作用，可以抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成，改變Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的比例。同時，槲皮素可以延長肝星狀細胞G1期，從而影響細胞的增殖及活性，可能是趕黃草等富含槲皮素的中藥可以達到臨床控制肝纖維化、肝硬化的發展的作用機制之一。但中藥的作用機制研究極為復雜，關于槲皮素對肝臟疾病的作用機制研究需大量的基礎實驗和臨床研究進行進一步深入的研究和探討。

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