MAGE-A9在結直腸癌中的表達及臨床意義*

陳建平，陳 茜，施秀英，關 茜，孔 俊，張 曙，朱慧君，王旭東△

(1.南通大學附屬醫院檢驗科，江蘇南通 226001；2.南通大學公共衛生學院醫學檢驗系，江蘇南通 226019；3.南通大學附屬醫院病理科，江蘇南通 226001)

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種全球最常見的消化道惡性腫瘤，是世界第3高發惡性腫瘤，其病死率居惡性腫瘤第4位[1]。在過去的幾十年里，盡管各種檢測方法、新型外科技術、輔助療法及靶向生物療法等技術迅猛發展使得CRC患者的5年生存率有所提高，但是CRC患者總體生存率仍然較低[2]。因此，深入研究CRC發生、發展的相關基因，尋找CRC早期診斷及治療的有效生物靶點，不僅具有重要的研究價值，而且具有巨大的臨床應用前景。黑色素瘤相關抗原家族(melanoma-associated antigen，MAGE)首先從黑色素瘤中發現，是一組腫瘤相關抗原[3]，目前已經發現了60多個成員。MAGE-A是MAGE的亞家族，MAGE-A基因在多種腫瘤異常表達[4]。MAGE-A9是新近被發現的MAGE-A家族的成員，研究發現其在黑色素瘤、喉癌、非小細胞肺癌、多發性骨髓瘤及肝癌中異常表達，并且與腫瘤的發生、發展密切相關[5-6]。但是，目前有關MAGE-A9在CRC組織中的表達及其臨床意義的相關報道較少。本研究擬觀察MAGE-A9在CRC組織及相鄰癌旁組織中的表達變化，以及其與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2006年1月至2008年12月在南通大學附屬醫院行手術治療、臨床資料完整且保留蠟塊的203例CRC患者為研究對象，男130例，女73例；年齡45～83歲(中位年齡64.1歲)。所有CRC患者在手術前均未經相關抗腫瘤治療，如放療、化療或手術前免疫治療等，并排除死于術后并發癥的患者。所有標本診斷標準、組織學類型和臨床分期按照2003版WHO腫瘤組織學分類標準及美國癌癥聯合委員會和國際抗癌聯盟分期系統分別進行病理分類及TNM分期[7-8]。每份組織標本由該院兩名病理學醫師進行病理診斷。本次研究所有患者均簽署知情同意書，并經過該院人類研究倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR測定 MAGE-A9 mRNA表達通過實時定量聚合酶鏈反應分析(qRT-PCR)進行測定。選取23例新鮮CRC及相應癌旁正常組織標本，TRIZOL(美國Life Techologies公司)提取RNA。按試劑盒說明書進行逆轉錄為cDNA，后進行PCR擴增。PCR反應條件如下：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，反應40個循環。以GAPDH作為內參，比較癌組織及癌旁組織MAGE-A9基因相對表達量。GAPDH引物如下：5′-CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC-3′(上游引物)和5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′(下游引物)，202 bp。MAGE-A9基因特異性引物如下：5′-CAC TGT ATG TCA TCT CTG-3′(上游引物)和5′-ACT ACT GTC ATT CAT TAA CT-3′(下游引物)，280 bp。試驗重復3次，取平均值進行分析。

1.2.2免疫組織化學染色 本研究采用EnVision 二步法進行免疫組織化學染色分析，試劑盒選購于北京中杉金橋生物技術有限公司。嚴格按照操作說明書進行石蠟切片中MAGE-A9蛋白檢測。MAGE-A9兔抗人單克隆抗體購自美國San Diego公司，生物素化山羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素(三抗)為試劑盒中的原液。顯色液進行免疫組織化學顯色，不定時在顯微鏡下觀察顯色程度；蘇木素復染，梯度乙醇脫水后封片、拍照。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。由該院病理科醫師閱片，每張切片隨機取5個400倍視野。按著色強度評分如下：細胞無著色得0分，細胞著淺黃色得1分，細胞著棕黃色得2分，細胞著棕褐色得3分。 按陽性細胞比例評分如下：陽性細胞百分比0%～10% 得1分，陽性細胞百分比大于10%～50% 得2分，陽性細胞百分比大于50%～80% 得3分，陽性細胞百分比大于80%～100% 得4分。將細胞著色強度和陽性細胞比例的乘積作為MAGE-A9著色分數結果進行判讀：≥3判為高表達，<3判為低表達[9-10]。

2 結 果

2.1MAGE-A9 mRNA在癌組織及癌旁組織中的表達 MAGE-A9 mRNA在癌組織和癌旁組織中的相對表達水平分別是44.92±8.03 和 3.81±0.93(P<0.05)。MAGE-A9 mRNA在癌組織中的表達是癌旁組織中的11.8倍。

2.2MAGE-A9蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達 免疫組織化學結果顯示，MAGE-A9蛋白在癌組織和癌旁組織中的高表達率分別是83.25%(169/203)和15.76%(32/203)，差異有統計學意義(P<0.01)。MAGE-A9蛋白主要定位于CRC細胞的細胞質(圖1)，個別CRC組織標本中MAGE-A9蛋白定位于間質細胞。

2.3MAGE-A9在CRC組織的表達與患者臨床病理參數的關系 CRC組織中高表達的MAGE-A9與患者腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表1，而與患者年齡、性別、腫瘤位置、組織學類型及術前CEA水平臨床病理參數無關。另外，有5例病例存在遠處轉移。

A、B、C、D:CRC組織中MAGE-A9呈陽性表達；E、F:MAGE-A9在癌旁組織中呈陰性表達；紅色箭頭：MAGE-A9定位于細胞質；綠色箭頭：MAGE-A9定位于間質細胞；A、C、E：×40；B、D、F：×400

圖1 免疫組織化學法檢測CRC組織和癌旁組織中MAGE-A9蛋白的表達表1 CRC組織中MAGE-A9表達與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

續表1 CRC組織中MAGE-A9表達與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

a：混合腺癌(管狀、黏液狀)10 例；黏液癌8例；印戒細胞癌2例；腺鱗癌1例

2.4MAGE-A9的表達與CRC患者預后的關系 基于單因素Cox回歸分析，MAGE-A9表達是CRC患者不良預后的危險因子(P<0.01)，腫瘤部位、腫瘤分化、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及術前CEA水平均是影響CRC患者預后的相關因素(P<0.01)，見表2。對上述影響患者預后的因素進一步進行多因素Cox風險比例函數模型分析。結果表明，MAGE-A9表達、腫瘤部位、腫瘤分化、TNM分期和術前CEA水平是影響CRC患者預后的主要因素，見表2。Kaplan-Meier 法生存曲線顯示高表達MAGE-A9組CRC患者的生存時間明顯低于低表達MAGE-A9組(P<0.01)。結腸腫瘤、低分化腫瘤、晚期TNM分期及術前高CEA水平患者的生存時間明顯較短(P<0.01)，見圖2。

圖2 MAGE-A9蛋白不同表達患者的生存曲線圖表2 單因素和多因素分析臨床病理特征對5年生存預后的影響

項目單因素分析nP95%CI多因素分析HRP95%CIMAGE-A9表達<0.016.537～34.7769.005<0.013.766～21.536 高109 低94年齡(歲)0.7360.678～1.735 <6075 ≥60128性別0.1140.408～1.101 男130 女73位置<0.012.044～6.0992.6010.0041.369～4.942 結腸153 直腸50組織學類型0.3500.292～1.547 腺癌182 其他a21分化程度<0.010.195～0.5130.4170.0040.231～0.751 高、中分化169 低分化34TNM分期<0.011.594～3.1282.1110.0191.129～3.948 0～Ⅰ46 Ⅱ80 Ⅲ～Ⅳ77浸潤深度<0.012.673～19.244 Tis+T17 T244 T3+4a152淋巴結轉移<0.011.214～1.785 N0125 N1a38 N1b20 N1c,N2a,2b20術前CEA(ng/mL)<0.011.691～5.2102.5250.0021.392～4.580 >1527 ≤15121

續表2 單因素和多因素分析臨床病理特征對5年生存預后的影響

a：混合腺癌(管狀、黏液狀)10 例；黏液癌8例；印戒細胞癌2例；腺鱗癌1例

3 討 論

MAGE是從黑色素瘤細胞系中發現并分離出的腫瘤特異性抗原基因[3]。MAGE基因分為MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ兩大亞組[3]。MAGE-A 為MAGE-I的成員之一。MAGE-A1～MAGE-A12是MAGE-A家族的幾個亞型，其中MAGE-A1和MAGE-A3是科學家們研究較為透徹的兩個亞型[4,7]。近年來研究發現MAGE-A9在肝癌、食管腺癌、喉鱗狀細胞癌等人類多種腫瘤組織中存在異常表達，并且與惡性腫瘤的侵襲轉移、不良預后密切相關[5-6]。有研究發現在某些腫瘤中MAGE-A9是進行個性化免疫療法的潛在靶點[8-10]。

在本次研究中，本課題組運用qRT-PCR法及免疫組織化學法分別檢測了MAGE-A9 mRNA和MAGE-A9蛋白在CRC腫瘤組織和相應癌旁組織中的表達差異。結果顯示MAGE-A9 mRNA和蛋白在CRC患者腫瘤組織中的表達均明顯高于癌旁組織。這些發現表明MAGE-A9在人類腫瘤中的多態性，預示MAGE-A9可能與腫瘤的發展和進程有關。

本研究比較分析了MAGE-A9表達與CRC患者臨床病理參數及臨床預后的關系。分析發現MAGE-A9高表達提示CRC患者腫瘤低分化、較晚的TNM分期或淋巴結轉移。本次研究中只發現5例遠處轉移病例，由于樣本量較少，因此沒有評估MAGE-A9和遠處轉移的關系。這些結果表明MAGE-A9可能在CRC的發生、發展中起了重要作用。運用Cox比例風險回歸模型進行單因素預后分析表明MAGE-A9表達、腫瘤部位、腫瘤分化、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及術前CEA水平與CRC患者預后有關。多因素預后分析進一步表明MAGE-A9高表達、腫瘤位置、腫瘤分化、TNM分期和術前CEA水平都是影響CRC患者預后的主要獨立因素。使用Kaplan-Meier法分析顯示，MAGE-A9低表達組CRC患者比MAGE-A9高表達組5年生存率長。這意味著MAGE-A9高表達提示臨床預后差，MAGE-A9的過表達是一個獨立的預后不良的重要標志，并可能成為CRC治療的一個參考指標。因此推斷在結直腸癌患者中，MAGE-A9從腫瘤早期即開始表達增高，在一定程度上起著癌蛋白的作用，其高表達在腫瘤細胞的生存、增殖中發揮了重要作用。此外，MAGE-A9高表達可能會打破人體內微環境平衡，在促進腫瘤細胞的增殖和遠處轉移過程中起著重要的作用。其機制需要通過體外細胞實驗研究進行深入探討。

有研究報道在喉鱗狀細胞癌MAGE-A9高表達于細胞質和間質細胞[11]。值得注意的是，本研究中發現在少數CRC病例中MAGE-A9表達于間質細胞。這種現象可能需要進一步擴大樣本量深入研究MAGE-A9在間質細胞表達的意義和潛在機制。

綜上所述，本次研究結果顯示CRC組織中MAGE-A9高表達，并與患者預后差密切相關。MAGE-A9可能是CRC診斷、預測CRC患者預后的重要指標，同時可作為CRC的潛在靶點個性化指導治療方案的選擇。

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