人胎盤間充質干細胞復合多孔羥基磷灰石支架的體內異位成骨效果

趙倩，陳爭暉，青薇，黃麗娟，牟雁東，，任小華

(1.西南醫科大學口腔醫學院，四川 瀘州 646000；2.四川省人民醫院，四川 成都 610000)

頜骨骨量不足或缺損是口腔種植中最常見的問題，特別是對于因腫瘤、外傷等造成大面積頜骨缺損的患者，目前的骨修復方式主要為自體骨移植、異體骨移植、人工骨移植等。其中人工骨移植可避免患者自身取材的痛苦和并發癥，以及同種異體骨免疫排斥的危險。故近年來骨組織工程的研究發展迅速，其具有良好的組織相容性及可重復性，有望成為骨缺損修復的良好替代物[1-3]。

本研究，應用人胎盤來源的間充質干細胞復合多孔HA支架在比格犬的背肌內異位成骨，探討多孔HA支架作為人工骨替代材料的異位成骨效果。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：12月齡比格犬3只，體重10～12 kg，雄性，四川省人民醫院動物實驗室提供。細胞：人胎盤來源的間充質干細胞(hPMSCs),四川大學生物治療國家重點實驗室提供。主要試劑及儀器：DMEM培養基、胎牛血清、消化用胰酶、青-鏈霉素(Gibco公司)；CO2培養箱(SANYO公司)；JSM-7500F掃描電鏡(日本日立公司)等。

1.2 細胞培養及傳代、三系誘導分化、鑒定及生物相容性

方法見文獻[4]。

1.3 多孔HA支架的制備與消毒滅菌

多孔HA支架由西南交通大學材料與生命工程學院制備：直徑6 mm，高3 mm，孔隙率80%，孔徑750～900 μm規格的多孔HA支架，材料的宏孔孔壁表面具有條紋樣微渠結構(圖1B)。環氧乙烷消毒，分裝備用。

1.4 構建細胞支架復合體

取出多孔HA支架放于6孔板中，用DMEM培養基預先浸泡48 h。取第5代處于指數增長期的hPMSCs，用PBS洗滌兩次后加入胰酶+EDTA消化3～5 min，再用含10%胎牛血清的DMEM培養基洗滌后，調整細胞懸液密度至終為2×105/mL，接種到已經處理好的多孔HA支架材料上，使材料剛好被細胞懸液浸潤，3 h后將多孔HA支架翻面，將細胞懸液接種在材料的另一面，3 h后加入含10%的胎牛血清的DMEM培養基至剛好沒過材料的頂面，構建好的組織工程骨在6孔板中共培養7 d，隔1～2 d換液1次。

1.5 掃描電鏡觀察人胎盤來源間充質干細胞在支架表面的黏附形態

細胞支架共培養2 d后取出，PBS清洗3次，2.5%戊二醛4 ℃固定24 h，體積分數為30%，50%，75%，85%，95%，100%梯度乙醇脫水，各15 min，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡觀察細胞在支架表面的形態。

1.6 多孔HA支架與細胞支架復合體植入比格犬背部

麻醉：犬禁食禁飲12 h，稱重后用戊巴比妥鈉3 mg/kg濃度行靜脈注射麻醉，俯臥位固定于手術臺，背部常規備皮，碘伏消毒，鋪無菌巾。切開、植入、縫合：分別于3只犬的背部脊柱兩側分各作1個長約4 cm縱行切口，以血管鉗鈍性分離皮下組織及淺筋膜，深達脂肪深層，直至顯露肌肉淺筋膜，再于暴露的肌層表面做3個長約1 cm縱行切口，分別以血管鉗探入切口擴大腔隙在肌肉之間形成約10 mm×10 mm的肌袋，將多孔HA支架和細胞支架復合體以生理鹽水或血液潤濕后，置入上述肌袋中，背肌左側3個肌袋中各放置1個多孔HA支架共9個為對照組，右側3個肌袋中各放置1個細胞支架復合體共9個為實驗組，再縫合該切口，使材料完全被肌肉包裹。稀釋碘伏、生理鹽水沖洗術野后，逐層縫合切口(圖2)。術后處理：術后用青霉素160萬單位肌注，2次/d，預防感染2 d。分籠飼養，給足量的食物、飲水。

1.7 取材及檢測

術后12周，以上述方法麻醉后，從比格犬背部皮下肌層取材，取出后剔除材料周圍肌肉組織并以生理鹽水沖洗植入物表面后放入10%中性甲醛固定液，再進行下一步HE、Masson、免疫組織化學染色實驗。

2 結果

2.1 術后組織愈合情況

術后3 d，所有犬只術后恢復良好，無感染等情況發生。

2.2 人胎盤來源間充質干細胞的形態

細胞呈典型的長梭形，大小均勻一致，集簇狀生長，螺旋狀排列，類似成纖維細胞樣形態，生長狀況良好，平均3～5 d傳代1次(圖1A)。

2.3 掃描電鏡觀察hPMSCs在支架表面黏附形態

hPMSCs在多孔HA支架中培養24 h后細胞的黏附情況佳，細胞傾向于沿著孔壁表面的條紋樣微渠結構排列生長(圖1C、D)。

2.4 HE染色組織學觀察結果

第12周時，兩組均有大量骨基質形成，但實驗組已經可見成熟骨板結構(圖3)。

2.5 Masson染色組織學觀察結果

植入12周時，組織切片中的紅染部分為成熟骨，實驗組明顯較對照組成熟骨的形成面積大(圖4)。

2.6 免疫組化染色組織學觀察結果

植入12周時，對照組OCN表達量強于實驗組，而實驗組的OCN在支架周圍基本無表達，表達主要集中于支架的孔洞中心(圖5)。

3 討論

組織工程骨主要由種子細胞、支架材料、生長因子三部分組成[5]。其中種子細胞研究較多的為骨髓間充質干細胞，但其在骨髓中含量僅有0.001%～0.01%[6]，且有研究表明，體外培養其傳代最大值為24～40代，以后細胞則會出現衰老和生長抑制現象[7]；脂肪干細胞屬于成體干細胞，不具備無限增殖和分化潛能，在體外長時間培養還有自發向惡性轉化的傾向[8]；胚胎干細胞來源廣泛、取材方便、具有全能分化能力，是胚胎發育早期囊胚內細胞團中尚未分化的細胞，能夠長期保持未分化性增殖，充分保持干細胞的多能性，與骨髓間充質干細胞有相似的生物學特性[9]。因此本研究所用種子細胞為人胎盤來源的間充質干細胞，為較理想的種子細胞來源。對于支架材料而言，應需具備的關鍵性能為良好的生物相容性、骨傳導及骨誘導作用。本研究所用多孔HA支架具體具備以下特性：(1)良好的生物相容性。(2)三維立體多孔結構。骨是一種新陳代謝率很高的組織，它需要大量的血管供應體內結構的平衡、生長和重建。本材料的多孔結構及適宜的孔隙率有利于種子細胞同外周環境進行物質交換，孔與孔間的貫通性既可為種子細胞的生長、增殖和分化提供充足的三維空間，又能促進新生血管和神經的長入[10]。(3)良好的材料-細胞界面。多孔HA支架表面的微溝槽結構使細胞傾向于沿著支架孔壁表面的條紋樣微渠結構排列生長，且保持長梭形，部分細胞伸出偽足，有利于細胞更加緊密的粘附于支架表面，為細胞的黏附和增殖提供了良好的界面[11]。(4)支架材料易于消毒、保存，消毒后支架材料的內部結構完整無破壞。

本實驗選取的異位成骨是指在非骨組織內成骨，一般可選擇植入肌袋內或皮下，與原位植骨比能夠排除在原位骨組織內植入時由于受體骨、骨膜本身成骨的假陽性結果，從而準確判斷植入物的成骨能力僅來自植入的組織工程骨，使研究結果更為真實可信。而肌肉組織中具有豐富的血液供應，移植后能夠提供良好的血供給組織工程骨，促進其成骨。故本實驗選擇異位成骨來研究多孔HA支架的成骨能力[12-13]。

從實驗結果來看，hPMSCs與骨髓間充質干細胞形態極其相似，在多孔HA支架中沿著支架表面的微溝槽結構排列，粘附情況佳，提示支架為細胞的黏附和增殖提供了很好的三維空間結構，為組織工程骨的良好支架材料。HE及Masson染色結果顯示，實驗組與對照組在比格犬背肌內異位成骨情況均較好，支架孔隙中均可見大量血管結構，證明支架材料結構非常有利于血管的長入，能夠為骨形成提供豐富的營養，以利于骨的形成[14-15]。實驗組骨基質面積與成熟骨板面積大于對照組，說明前者成骨效率可能大于后者，提示hPMSCs細胞可能在成骨過程中持續發揮重要作用，在多孔HA陶瓷支架的誘導下向著成骨細胞、骨細胞方向分化，從而成骨效果更佳。免疫組織化學染色的OCN的表達情況顯示，在12周時對照組成骨活躍，而實驗組可見支架表面基本沒有OCN的表達，提示此時支架表面已經成骨，僅在支架的孔洞中心還存在活躍的成骨行為，表明實驗組成骨性能優于對照組。

綜上實驗初步探討了人胎盤間充質干細胞復合多孔HA支架體內的異位成骨效果，實驗結果顯示兩組在比格犬背肌內異位成骨效果均佳，實驗組成骨效果優于對照組，提示體外培養的人胎盤來源間充質干細胞能夠促進新骨的形成。

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