glypican1在識別和鑒定早期胰腺癌中的作用

馬洪波　韓　風

(河南省腫瘤醫院　鄭州大學附屬腫瘤醫院肝膽胰外科，河南　鄭州　450008)

90%的胰腺癌為起源于腺管上皮的導管腺癌，它是最難診治和預后最差的消化道惡性腫瘤之一，5年生存率小于1%〔1〕。早期胰腺癌臨床癥狀不明顯，患者一旦發現身體不適，癌細胞已經擴散至全身多種組織和器官，近年來，胰腺癌的發病率和死亡率明顯上升，早期診斷的準確率很低，手術死亡率很高，治愈率很低，胰腺癌越早治療，效果越好，因此，早期診斷對胰腺癌患者的治療和預后具有重要意義〔2，3〕。Glypican1在胰腺癌患者體內濃度很高，胰腺癌細胞釋放一種微小的環狀脂肪外泌體，其內含有DNA、RNA和蛋白質，膜表面和胞質內含有大量的glypican1。glypican1在胰腺癌和乳腺癌中選擇性地高表達，具有極高的特異性〔4〕。因此，在臨床檢測中，將glypican1作為檢測早期胰腺癌的標志物具有重要的臨床意義〔5〕。本文分析glypican1在早期胰腺癌中的鑒別診斷價值。

1　對象與方法

1.1研究對象2013年1月至2015年1月河南省腫瘤醫院肝膽外科因胰腺癌行外科手術的患者50例，其中男30例，女20例，平均年齡(56.5±3.5)歲。因胰腺癌良性病變如慢性胰腺炎、胰腺囊腺瘤和胰腺假性囊腫等行外科手術的患者50例，其中男18例，女32例，平均年齡(60.5±2.5)歲。患者均符合《中華人民共和國衛生行業標準》，患者及其家屬均簽署書面知情同意書。

1.2檢測方法按常規方法收集胰腺良性病變患者和胰腺癌患者的肘靜脈血，4℃冰箱儲存備用。超速離心收集glypican1+外泌體，用流式細胞儀分離glypican1+外泌體。兩組均于術前空腹采集外周血5 ml，離心分離血清，采用電化學發光法檢測糖鏈抗原(CA)19-9水平，陰陽性臨界值為39 U/ml。計算CA19-9陽性率。提取病變組織和glypican+外泌體中的DNA，采用突變等位基因特異性擴增法(PCR-MASA)檢測K-ras基因點突變。以病變組織診斷結果為金標準，計算glypican1+外泌體檢測的敏感性特異性和診斷準確率。

1.3統計學方法采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1glypican1+外泌體檢測胰腺癌的效能glypican1+外泌體檢測胰腺癌的敏感度、特異性和準確性均顯著高于CA19-9和K-ras基因突變檢測(P<0.05)。見表1。

表1　glypican1+外泌體檢測胰腺癌的效能〔n=50,n(%)〕

與glypican1+外泌體比較：1)P<0.05

2.2良性組和胰腺癌組glypican1+外泌體陽性率比較良性組和胰腺癌組glypican1+外泌體陽性率明顯高于CA19-9和K-ras基因突變檢測(P<0.05)；與良性組相比，胰腺癌組的glypican1+外泌體陽性率更高(P<0.05)。見表2。

與glypican1+外泌體比較：1)P<0.05；與良性組比較：2)P<0.05

3　討　論

胰腺癌主要指胰腺外分泌胰腺癌，臨床上最常見的是導管腺癌，預后極差，絕大多數患者在確診時已經不能采用手術治療。

硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)通過磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上，glypican是HSPG中很特殊的一種類型，目前，哺乳動物中共發現6種glypican，glypican通常作為共受體易化配體和受體的相互作用〔6，7〕。glypican在正常發育和多種癌癥的發生發展中起著重要作用，在不同癌癥中的表達差異很大，glypican1，3，5都與腫瘤發生發展息息相關，主要影響細胞增殖、分化和凋亡，表達該蛋白的基因突變后，癌細胞的增殖和凋亡均發生很大改變，這是癌癥發生轉移的重要原因。glypican1在人類神經膠質瘤、胰腺癌和乳腺癌細胞中的表達量增加，glypican5與橫紋肌腫瘤的發生發展密切相關，glypican3在腫瘤中的作用待定，有一些研究表明，它可促進肝癌細胞增殖，但其在間皮瘤、卵巢癌和乳腺癌中處于沉默狀態〔8～11〕。

胰腺癌是致死率極高的一種癌癥。每100例胰腺癌患者中，只有3例可以存活5年以上，而且，近40年來，此癌癥的存活率并沒有提高。由于胰腺癌是最難早期發現和治療的癌癥之一，確診時常常已到晚期，只有15%左右的患者適合于接受手術，在早期診斷胰腺癌可以降低胰腺癌的死亡率，因此，胰腺癌的早期診斷一直是研究的重點和難點，尋找準確率高的生物學標志物迫在眉睫〔12～14〕。Glypican在各種癌癥中的表達有很大差異，在子宮內膜癌、肺癌、卵巢癌和食管癌中表達量很低，在胰腺癌、乳腺癌、肝癌、大腸癌和黑色素瘤中表達量很高。在不同的癌癥中，glypican發揮不同的作用，甚至可能起到完全相反的作用〔10，15，16〕。

胰腺癌外泌體含有glypican1蛋白，可以作為一種潛在的非侵入性的診斷和篩查工具，在臨床上用于檢測和診斷有可能尚處于適合手術治療階段的早期胰腺癌。胰腺癌的早期診斷十分困難，其臨床癥狀與急慢性胰腺炎很相似，有時候很難區分胰腺癌和胰腺炎，因此，胰腺癌的早期診斷成為提高胰腺癌患者生存率和預后的關鍵。

外泌體是由癌細胞分泌至細胞外的一種直徑在50～150 nm的顆粒，由磷脂雙分子層包裹著DNA、RNA和蛋白質，可以隨著血液系統循環，癌癥外泌體不僅僅是一種生物標記物，分析外泌體可以獲得許多癌癥特異性的遺傳突變信息〔17，18〕。早期胰腺癌患者血液中含有富含glypican1的循環外泌體，具有絕對的特異性和敏感性，這些早期胰腺癌患者手術切除癌組織后，glypican1循環外泌體顯著下降。檢測循環外泌體具有很多優勢，只需少量新鮮或凍存的胰腺癌患者血液，可同時分析DNA、RNA和蛋白質等，與循環腫瘤細胞和常用的CA19-9相比，具有更高的特異性和準確性，價格低廉，假陽性低。據報道，在胰腺癌小鼠模型中，磁共振成像(MRI)還未檢測到胰腺癌疾病跡象時，glypican1外泌體就可以準確檢測到早期胰腺癌〔19，20〕。在早期胰腺癌臨床檢測中，glypican1循環外泌體的檢測可與影像學聯合使用，提高檢測的靈敏度和準確率。癌癥細胞和正常細胞都能分泌外泌體，但是目前并無特異性的標志物來區分這兩種外泌體，因此，發現并分離癌癥特異性的外泌體且不被正常細胞的外泌體污染，對癌癥的診斷和治療具有重要的臨床意義〔20～22〕。CA19-9是最常用的胰腺癌標志物之一，但由于其特異性很低，在臨床上的應用受到很多限制。

癌癥細胞可以釋放數百萬攜帶自身蛋白和遺傳物質的外泌體，通過循環系統到達受納器官，促發炎癥和血管形成等過程，讓轉移至受納器官的腫瘤細胞更容易增殖并形成新的轉移灶，進一步驗證了Paget在126年前提出的“種子與土壤理論”學說〔23～25〕。

從早期胰腺癌患者血液中分離出的glypican1循環外泌體中含有K-ras、p53、Tp53、p16、Ink4a/Arf和DPC4/Smad4等基因突變的DNA片段。K-ras家族有3個成員，即H-ras、N-ras和K-ras，K-ras癌基因點突變激活是胰腺癌最早發生的點突變，在胰腺癌組織中最為常見，臨床上常用來診斷早期胰腺癌，在患者的胰腺組織、胰液、糞便、膽汁及血漿中均可檢測到K-ras突變，但其靈敏度和特異性均不穩定。K-ras常見基因突變位點為第12、12、61位密碼子，以第12為密碼子的突變最為常見。

本研究結果表明，與CA19-9和K-ras基因突變檢測相比，glypican1+外泌體檢測具有早期識別胰腺癌更高的臨床應用價值。

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