山茶籽醇提物對去卵巢AD大鼠學習記憶、腦組織p-tau蛋白的影響

李　海　解繼勝　楊　潔　黃月妹　黎　飚

(右江民族醫學院組織胚胎學教研室,廣西　百色　533000)

腦組織p-tau蛋白增多引起神經纖維纏結、β樣淀粉蛋白(Aβ)在腦組織沉積引起大腦中樞的組織損害，在皮下組織Aβ沉積，引起皮膚老年斑，這些病變是阿爾茨海默病(AD)的病理基礎〔1～3〕。本文主要探討山茶籽醇提物對去卵巢AD大鼠學習記憶、腦組織p-tau蛋白的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用5月齡SPF級雌性SD大鼠40只，體質量為(350±20)g，為右江民族醫學院實驗動物中心所提供。大鼠均在(25±2)℃、燈光12 h進行交替，相對的濕度為56%條件規范喂養。隨機分為假手術組、模型組、山茶籽組、雌二醇(E2)組各10只。

1.2模型建立30只大鼠用濃度為10 g/L 的戊巴比妥鈉水溶液進行腹腔注射(3.0 mg/kg)，檢查大鼠麻醉適度后，經腰背部雙切口入腹腔，切除卵巢，切口逐層縫合。所切除物均經過組織學切片觀察確認。切除卵巢后用硫酸慶大霉素肌注3 d，預防切口感染，并持續3 d。去卵巢1 w后，用濃度為10 g/L的戊巴比妥鈉水溶液進行腹腔注射(麻醉劑量為3.0 mg/kg)。將大鼠固定在大鼠專業腦立體定位儀器上，使大鼠前囟暴露于正中切口，把前囟作為原點，向后4.3 mm、旁開2.1 mm為進針點進行顱骨鉆孔。從大腦表面緩慢進針達3.1 mm到達雙側海馬處，緩慢注入Aβ25～35 1 μl(10 μg，使用微量注射器)，并且留針5 min，確保海馬區局部內的組織被注射物浸潤充分。造模術后用硫酸慶大霉素肌肉注射避免感染。在顱內注射Aβ25～35結束3 d之后，使用100 mg/kg D-半乳糖并用0.9%生理鹽水注射液溶解、稀釋至2 ml再進行腹腔注射，1次/d，持續14 d。假手術組：與模型組手術過程相同，只切去卵巢旁邊的一小塊脂肪，保留卵巢，和AD大鼠模型組同樣開顱鉆孔用等容量0.9%鹽水注射海馬局部。

1.3實驗動物用藥山茶籽組：用山茶籽榨油后的殘余物(茶麩)的醇提物進行灌胃，10 ml·kg-1·d-1(5 g生藥/g)；E2組：用E2進行皮下注射，按200 μg/kg，2次/w；模型組和假手術組給予等體積的0.9%生理鹽水進行灌胃，10 ml/kg，1次/d。

1.4Y型水迷宮實驗對各組大鼠8 w實驗后的學、記能力測試。在水迷宮水池的中央放置一個水深1.5 cm處的平臺，測試各組大鼠空間方位學習及空間方位記憶能力。

1.5免疫組化法檢測腦組織p-tau蛋白含量水平①心臟灌注并取腦，用10 g/L濃度的異戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露大鼠心臟，取其左心室血5 ml，并用500 ml 0.9%鹽水進行快速灌注。隨后斷頭取腦，左側腦固定液進行固定腦組織(低溫保存用固定10%甲醛溶液)，隨后按常規制作切片并染色。右側大腦勻漿(在低溫條件)。②腦組織切片使用免疫組織化學法雙重染色，切片置于室溫下進行1.5 h干燥,然后用足量PPS液進行反復洗滌，每次洗滌20 min。洗滌后將含0.1%TritonX-100山羊的血清滴注在大鼠腦海馬的組織切片上，孵育35～45 min。再次使用抗p-tau的單克隆抗體(1∶400)在4℃的孵化池孵化過夜。次日，在Cy3 標記的二抗(1∶200)濕盒進行孵化2.0～3.5 h。用免疫組化法對大腦組織切片進行染色使用顯微鏡觀察并記錄結果。

1.6Western印跡法檢測腦組織p-tau蛋白在低溫條件下腦組織勻漿并提取p-tau蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。加入45 μg 蛋白樣品于凝膠泳道里，電泳使相關目的蛋白帶到達膠板的中間點即可斷電。電泳后進行聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜，轉膜后，在室溫下用5%牛奶封閉PVDF 膜2 h，之后加注一抗(p-tau蛋白單克隆兔抗抗體，1∶400；p-tau蛋白抗大鼠的多克隆抗體，1∶10 000)4℃孵化過夜。TBST反復3次洗膜，每次洗膜5 min。注入兔二抗(辣根的過氧化物酶的標記，1∶20 000)室溫孵化2 h，用TBST洗膜，5 min/次，連續3次。用電化學發光(ECL)試劑盒發光，凝膠成像分析系統下進行觀察，并利用相關灰度檢測軟件掃描出灰度值。

1.7數據處理應用SPSS15.0軟件進行方差分析。

2　結　果

2.1各組造模前后Y型水迷宮實驗結果比較見表1。假手術組造模前后到達平臺時間和錯誤率差異均無統計學意義(均P>0.05)；模型組造模后到達平臺時間顯著長于造模前(P<0.05)，錯誤率顯著高于造模前(P<0.01)；山茶籽組及E2組造模前后到達平臺時間差異均無統計學意義(均P>0.05)，造模后錯誤率均顯著降低(均P<0.01)。與假手術組比較，模型組造模后錯誤率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，山茶籽組及E2組造模后錯誤率顯著降低(均P<0.01)；E2組與山茶籽組造模后錯誤率差異無統計學意義(P>0.05)。

表1　各組大鼠到達平臺時間及錯誤率比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01

2.2各組p-tau蛋白陽性細胞計數比較與假手術組(9.32±0.52)比較，模型組海馬CA1區p-tau蛋白陽性細胞數(75.12±8.73)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，山茶籽組(24.31±4.02)及E2組海馬CA1區p-tau蛋白陽性細胞數(18.17±2.12)明顯減少(均P<0.01)。

2.3各組腦組織p-tau蛋白水平比較見圖1。與假手術組(0.12±0.03)比較，模型組海馬CA1區p-tau蛋白光密度值(0.27±0.02)明顯增大(P<0.01)；與模型組比較，山茶籽組(0.16±0.043)及E2組p-tau蛋白的光密度值(0.15±0.02)明顯降低(均P<0.01)；E2組與山茶籽組p-tau蛋白的光密度值差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1　各組腦組織p-tau蛋白Western印跡電泳圖

3　討　論

神經元骨架的主要成分是微管系統，其與神經細胞多種功能活動密切相關。微管由微管管狀蛋白和相關蛋白質構成，tau蛋白在微管相關蛋白中含量最高。正常腦組織中tau蛋白能夠促進微管蛋白與微管相關蛋白結合從而聚集成微管； tau蛋白與微管相結合，降低微管的穩定性，導致微管蛋白分解，并誘導微管進一步形成微管束。tau蛋白的等位基因位置在17染色體的長臂上。在正常人群中tau蛋白表達mRNA形式的差異，可剪輯出6種不同的同功異構體。tau蛋白屬于磷酸基類蛋白，正常的成熟腦組織中tau蛋白分子中含有2～3個磷酸基團。而在AD患者腦組織中的tau蛋白則表現出過度磷酸化，每分子tau蛋白的磷酸基含量有5～9個，形成多個磷酸基的p-tau蛋白,引起神經纖維纏結及中樞神經病理改變〔4〕，并喪失正常生物功能。

本研究結果證明山茶籽榨油后的茶麩醇提物在對AD大鼠模型治療效果明顯，因為榨油后的山茶籽殘余物(茶麩)提取物有E2樣作用，通過降低膽堿酯酶的生物活性，避免乙酰膽堿過度水解，增加腦組織膽堿濃度，增強大腦中樞的神經興奮性和活動能力〔5〕，從而改善AD大鼠模型臨床癥狀；山茶籽榨油后的茶麩乙醇提取物所含的植物性雌激素內含豐富羥基成分，羥基有天然強抗氧化特性〔6〕，從而抑制p-tau蛋白和D-半乳糖在大腦組織堆積和損害，起到防治AD的作用；在腦組織里，雌激素與雌激素受體相結合還有擴張腦組織血管效應，腦組織的血流量增加，也可以使p-tau蛋白在腦組織的沉積減少、損害減輕〔7，8〕；植物性雌激素進入體內促進神經內分泌細胞合成和分泌α-分泌酶，α-分泌酶是水解淀粉蛋白前體酶，有促使淀粉蛋白前體分解和排出作用，減少p-tau蛋白在腦組織的沉積，從而消除或減少AD腦組織病理改變和臨床表現〔9〕。綜上，榨油后山茶籽的茶麩其乙醇提取物含有植物性雌激素〔10〕，有抗AD作用，特別在防治雌激素缺乏的AD作用更為明顯。

1沈悌.21世紀我國老年醫學發展方向〔J〕.中國實用內科雜志，2011;31(1)：6-7.

2Lopez-otin C,Blasco MA,Partridge L,etal.The hallmarks of aging〔J〕.Cell,2013;153(6):1194-217.

3Sprott RL.Biomarkers of aging and disease:introduction and definitions〔J〕.Exp Gerontol,2010;45(1):2-4.

4宋錦秋，陳曉春，張靜，等.人參皂苷Rb1通過JNK/p38 MAPK途徑減輕Aβ25-35 誘導的胎鼠皮層神經元tau蛋白過度磷酸化〔J〕.藥學學報，2008；43(1)：29-34.

5趙莘瑜，許予明，常程.美金剛與多奈哌齊治療中度阿爾茨海默病的對照研究〔J〕.鄭州大學學報(醫學版)，2010;45(4)：597-9.

6李海，解繼勝，陳建海，等.葛根素對阿爾茨海默病模型大鼠療效的觀察〔J〕.鄭州大學學報(醫學版)，2013;48(3)：352-5.

7Merlo S,Sortino MA.Estrogen activates matrix metalloproteinases-2 and-9 to increase beta amyloid degradation〔J〕.Mol Cell Neurosci，2012;49(4):423-9.

8Morinaga A,Ono K,Takasaki J,etal.Effects of sex hormones on Alzheimer′s disease-associated β-amyloid oligomer formation in vitro〔J〕.Exp Neurol，2011;228(2):298-302.

9楊紅旗，孫治坤，蔣秋煥，等.雌二醇對大鼠皮質原代神經元α分泌酶活性的影響〔J〕.鄭州大學學報(醫學版)，2009;44(5)：999-1003.

10李海，陳建海，王金花，等.山茶籽聯合雌二醇對去卵巢大鼠骨組織的影響〔J〕.解剖學雜志，2012;35(3)：286-8,318.