二氫睪酮聯合脂肪源性干細胞對小鼠坐骨神經缺損后腦源性神經營養因子及其受體TrkB表達的影響

王　瑩　李文媛　尹國華　李智剛　金在順　滕誠毅　孫　平

(牡丹江醫學院解剖教研室，黑龍江　牡丹江　157011)

近年發現性腺類固醇激素睪酮為中樞神經系統損傷后許多病理生理改變提供廣泛的神經保護和治療作用〔1〕。睪酮可通過抑制氧化應激反應進行神經保護和防止神經元死亡，降低炎癥和自由基表達，并能夠加速失神經軸突再生和功能恢復〔2〕。有研究表明睪酮還能夠顯著促進腦源性神經營養因子(BDNF)等表達〔3〕，但其在周圍神經再生的作用及其機制報道較少。我們前期研究〔4〕已證實同種異體脫細胞異體神經(ANA)能夠有效橋接坐骨神經缺損，但單獨使用ANA運動功能恢復效果并不理想。本研究擬將脂肪源性干細胞(ADSC)作為種子細胞植入ANA橋接坐骨神經缺損，并聯合在體內具有較強睪酮活性的雄激素二氫睪酮(DHT)治療，探討DHT聯合ADSC對坐骨神經缺損后小鼠BDNF信號通路和功能恢復的影響。

1　材料和方法

1.1細胞培養參照前期研究方法取小鼠腹部脂肪組織進行ADSC分離、培養及傳代〔4〕，2 w后茜草素紅染色鑒定ADSC向成骨誘導的細胞，經細胞鑒定后取第4代ADSC行PKH26(Sigma公司，美國)染色標記〔5，6〕，進行體內移植實驗。

1.2動物模型30只6～8周齡C57BL/6小鼠(雄性15 只，雌性15 只)，由中國醫科大學實驗動物中心提供，體質量18～22 g，按體質量隨機分為：①ANA組：采用化學萃取脫細胞方法〔5〕制備CD1小鼠ANA，注入100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)于ANA，橋接長5 mm坐骨神經兩斷端間的缺損，n=10；②ADSC組：注入等劑量ADSC(1×106個/100 μl)于ANA橋接坐骨神經缺損，n=10；③DHT + ADSC組：同ADSC組方法進行ANA橋接后，皮下給予DHT0.2 ml(含有DHT 0.8 mg密度為4.0 mg/ml的醫用玉米油溶液，Sigma公司，美國)注射〔7〕，1次/d，給藥1 w，n=10。3組術后28 d麻醉取材。

1.3坐骨神經功能指數(SFI)參照前期研究方法行SFI檢測〔6〕，術后28 d，制備1個塑料通道(8.5 cm寬，50 cm長)，底部放置一張70 g白紙，黑色墨水蘸在小鼠雙側后足從通道一端行走至另一端，每個后足印在紙面3～4個足印，檢測足趾寬度(TS)、足趾長度(PL)及中間足趾寬度(ITS)。

1.4電生理檢測采用經顱磁刺激MEP(tcMMEP)方法〔1〕，應用Magstim Model 200 磁刺激器(Magstim 公司，英國)和誘發電位儀(NIHON KOHDEN公司，日本)經顱磁刺激運動誘發電位觀察小鼠坐骨神經損傷后發生神經傳導潛伏期、傳導速度及波幅改變，將電磁線圈置于顱骨激活皮層下組織誘發tcMMEP反應，探查電極置于腓腸肌肌腹，參考電極插入肌腱，接地電極插入尾巴。每只小鼠每側均檢測3次，每次間隔1 min，結果取平均值。

1.5Western印跡檢測神經移植體內DNF表達及其受體TrkB術后28 d，小鼠麻醉取ANA沖洗，剝離硬膜放置干冰保存，電泳分離蛋白樣品(20 μg)后轉膜、封閉，加入一抗：兔抗BDNF抗體(1∶200，Sigma公司，美國)和兔抗TrkB抗體(1∶200，Sigma公司，美國)，4℃過夜，加入二抗(1∶5 000)孵育1 h，使用增強化學發光檢測系統(GE Healthcare公司，英國)觀察蛋白印跡。

1.6免疫熒光組化染色將快速分離的ANA置于含4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，常規免疫組化染色，一抗為兔抗NF200(1∶200，Sigma公司，美國)，二抗為FITC(1∶200，Sigma公司，美國)，熒光顯微鏡下觀察并同時示蹤PKH26標記的ADSC。每張切片400倍鏡下隨機選取4個視野檢測光密度(IOD)值。

1.7統計學方法應用SPSS13.0軟件行t檢驗及單因素方差分析。

2　結　果

2.1ADSC培養與分化原代培養ADSC 8 d后形成的細胞群落較為密集，ADSC呈多角形或梭形伸展，有鋪路石狀特征。ADSC分化誘導成骨28 d后，可見分化細胞內的鈣沉積茜素紅染色，見圖1。

圖1　ADSC培養與分化(×200)

2.2Western印跡結果DHT + ADSC組和ADSC組ANA中BDNF及其受體TrkB蛋白表達較ANA組顯著增高，其中DHT+ADSC組BDNF及其受體TrkB蛋白表達顯著高于ADSC組(均P<0.001)，見圖2，表1。

表1　各組Western 印跡蛋白相對表達

與ANA組比較：1)P<0.05；與ADSC組比較：2)P<0.05，表3同

2.3免疫熒光染色觀察熒光顯微鏡下可見DHT + ADSC組和ADSC組在ANA中段有PKH26標記的ADSC，而DHT + ADSC組PKH26陽性表達顯著高于ADSC組(t=6.715，P<0.001)。免疫熒光法染色NF200檢測神經支架中段軸突生成情況，與ADSC組比較，DHT + ADSC組NF200表達顯著增加(t=22.542，P<0.001)，見圖3，表2。

圖3　術后4 w ADSC組和DHT + ADSC組神經移植體中段PKH26和NF200免疫組化熒光染色(×200)

表2　各組PKH26和NF200的IOD值

與ADSC組比較：1)P<0.05

2.4SFI檢測結果術后28 d，與ANA組(-72.32±6.05)和ADSC組(-68.87±7.52)比較，DHT + ADSC組SFI指數顯著增高(-54.30±5.45，F=24.62，P<0.001)，而ANA組與ADSC組SFI指數差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5神經電生理檢測與ANA組比較，ADSC組和DHT + ADSC組神經傳導速度及波幅顯著增加，而延遲期顯著縮短，其中DHT+ADSC組改善神經電生理參數明顯優于ADSC組 (神經傳導速度：F=65.22，P<0.05；延遲期：F=14.32，P<0.05；波幅：F=19.65，P<0.05)，見表3。

表3　各組神經電生理參數檢測

3　討　論

目前發現近端周圍神經病變或完全橫斷的預后普遍較差，運動功能恢復緩慢。其中主要原因是適宜神經生長的微環境缺乏，軸突生長底物和神經營養因子減少及受損軸突內在生長速度太慢，導致再生軸突需較長時間連接遠端失神經支配的神經、不能重新支配靶組織，其功能恢復并不理想〔8〕。

前期研究發現〔4，5〕ANA由于脫去了周圍神經的細胞成分，保存了神經天然結構，具有較好的組織相容性，能夠為神經缺損提供良好的神經生長微環境。而種子細胞ADSC可合成和分泌大量神經營養因子，如神經生長因子、血管內皮生長因子等，這些促進神經生長的因子表達變化提供軸突生長的營養。本研究也再次證實ADSC能夠促進ANA橋接神經缺損后功能恢復，但SFI結果表明ADSC組神經功能恢復效果并不盡如人意，盡管其SFI有增高趨勢，且有研究證實〔6，9〕聯合治療能夠克服多種抑制神經軸突再生的因素，較單一治療效果更為明顯。在中樞神經系統中，睪酮能夠促進體外培養的海馬神經元存活，防止皮質錐體細胞損傷誘導的樹突萎縮〔3〕，促進腦卒中后早期功能恢復，并刺激周圍神經損傷后運動神經元軸突的生長〔10〕。而在周圍神經系統中，睪酮能夠加速面神經、舌下神經、坐骨神經軸突再生和神經切斷后功能恢復〔2，11〕，但其促進軸突再生的機制尚不明確，本研究證實DHT治療能夠有效激活BDNF細胞信號，這與以往研究結果相一致〔3〕，其機制可能是BDNF的表達是通過鈣依賴的信號通路進行調節，而cAMP反應元件(CRE)和cAMP反應元件結合蛋白(CREB)參與其信號通路發揮調節作用。睪酮已證實能夠有效激活CRE和CREB，因此，睪酮介導cAMP信號通路能夠調控和促進BDNF產生〔10〕。本研究推測DHT可能通過激活BDNF細胞信號，促進移植的ADSC增殖和存活，進而促進軸突的再生，且DHT聯合ADSC能夠協同促進神經功能恢復。

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