替米沙坦對4%高鹽飲食誘導腎臟纖維化的保護作用

趙　宇　劉　燕　商黔惠　王曉春　劉　嬋　劉　娟

(遵義醫學院附屬醫院臨床醫學研究所　心血管病研究所　高血壓研究室，貴州　遵義　563003)

原發性高血壓是由多種遺傳因素和環境因素共同作用的疾病，鹽作為一種重要的環境因素，在高血壓的發生發展中發揮重要作用〔1〕。研究表明，腎臟和鹽敏感性有著密切關系,腎臟纖維化是高鹽飲食引起腎臟損害的重要病理表現，而轉化生長因子(TGF)-β1/Smads信號通路是腎臟纖維化發生過程中最重要的信號通路〔2〕。TGF-β信號系統參與多種慢性腎臟損傷的病理生理過程，主要包括促進細胞外基質集聚、誘導足細胞凋亡和腎小管上皮細胞轉分化等〔3〕。替米沙坦能明顯降低血壓、改善高血壓腎損害，但其機制尚不明確。本實驗研究替米沙坦對高鹽誘導腎臟損害的保護作用及抗纖維化的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組4周齡清潔級雄性Wistar大鼠36只，均購于第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心，許可證號：SCXK-(渝)2007-0005。大鼠適應性飼養1 w后隨機分為3組：普食組 12只：予0.5%NaCl的顆粒飼料喂養；高鹽組 12只：予4%NaCl的顆粒飼料喂養；高鹽+替米沙坦組12只：予4%NaCl的顆粒飼料喂養+替米沙坦40 mg·kg-1·d-1灌胃。動物室溫度22℃～25℃，濕度45%左右。晝夜交替12 h，大鼠自由飲水，每天更換一次墊料，保持墊料干燥。實驗每4 w用Softron BP-98A大小鼠無創測壓儀進行尾動脈收縮壓的測定。

1.2主要試劑含NaCl 分別為0.5%和4%的顆粒飼料，購自廣東省醫學實驗動物中心,許可證號：SCXK-(粵)2008-0002。替米沙坦原料(上海現代制藥股份有限公司)，小鼠抗β-actin單克隆抗體(武漢博士德生物技術有限公司)，兔抗TGF-β1多克隆抗體、山羊抗Smad2/3多克隆抗體、小鼠抗Smad7 多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.324 h尿液的收集實驗第24周，將各組大鼠分別用代謝籠適應性飼養后，收集24 h尿液，用尿生化儀檢測尿微量白蛋白(MAU)、尿肌酐(Cr)。

1.4標本收集24 w實驗末，將各組大鼠稱重，10%水合氯醛40 mg/kg麻醉，從頸動脈插管采血，加入血生化管中，將生化管放入半徑15 cm離心機中4 000 r/min離心10 min，-80℃冰箱保存待測。取出兩側腎臟置冰盒上，投入冰冷的生理鹽水中清洗，去除脂肪及被膜組織，置濾紙上吸干后放電子天平上稱重。將右腎橫切為兩半，取上極分離皮質，將中間厚度約0.3 cm的組織塊在4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h，石蠟包埋，切片，用做蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色，其余腎臟組織分離出腎皮質-80℃冰箱保存。

1.5HE染色檢測腎臟形態學變化制備各組腎皮質蠟塊切片，厚度約10 μm，常規脫蠟、水化，滴加蘇木素染色4 min，返藍沖洗后滴加伊紅染色2 min，酒精脫水、烘干后中性樹膠封片。用Leica光學顯微鏡在400倍下觀察腎臟腎小球、腎小管等形態學改變。

1.6Masson染色檢測腎臟纖維化程度制備各組腎皮質蠟塊切片，厚度約10 μm，常規脫蠟、水化，現配蘇木素染液3 min，返藍沖洗后滴加1%麗春紅酸性復紅液30 min后，清洗后滴加1%磷鉬酸數秒，清洗后滴加2%亮綠2～3 min，清洗烘干后中性樹膠封片。采用Leica圖像分析儀進行半定量分析:在同一條件下對每張標本選取6個不重復的腎小球視野(×400)，將腎小球內呈現為綠色的纖維區域視作陽性目標，以陽性面積與腎小球總面積的比值作為腎小球纖維化指數。

1.7各蛋白表達的檢測將各組大鼠腎皮質用蛋白提取試劑盒提取蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉1.5 h，然后加入一抗(1∶1 000 α-SMA 、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)4℃孵育過夜，然后加入二抗(1∶2 000相應二抗)孵育1 h,洗膜后顯影。使用凝膠成像系統采集圖像，以目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的光密度值比值表示其相對表達量。

1.8統計學方法應用SPSS13.0軟件，正態分布資料組間比較采用單因素方差分析,方差齊使用LSD法,方差不齊使用Tamhane T2法。

2　結　果

2.1各組尾動脈收縮壓的變化從第8周起，高鹽組及高鹽+替米沙坦組尾動脈收縮壓顯著高于普食組(P<0.05)，與高鹽組比較，高鹽+替米沙坦組大鼠尾動脈收縮壓顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1　各組尾動脈收縮壓的變化

與普食組相比:1)P<0.05;與高鹽組相比:2)P<0.05，下表同

2.2各組腎臟生化指標比較與普食組相比，高鹽組及高鹽+替米沙坦組雙腎重量/體重、尿MAU均明顯增加(均P<0.05)，Ccr顯著降低(P<0.05)；替米沙坦組尿MAU較高鹽組顯著下降(P<0.05)，但雙腎重/體重及Ccr與高鹽組比較差異無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2　各組腎臟生化指標的變化

2.3各組腎皮質HE染色結果與普食組相比，高鹽組腎小球硬化、腎小管肥大，而替米沙坦組能明顯改善腎小球硬化。見圖1。

2.4各組腎皮質Masson染色結果及腎小球纖維指數比較與普食組相比，高鹽組腎小球膠原纖維明顯增加，替米沙坦組與高鹽組比較腎小球膠原纖維明顯減少。進一步計算腎小球纖維化指數，高鹽組腎小球纖維纖化指數較普食組明顯增加〔(20.93±1.14) vs (13.55±1.13)，P<0.05〕，替米沙坦組(13.83±1.19)較高鹽組明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖1　各組腎皮質HE染色結果(×400)

圖2　各組腎皮質Masson染色結果(×400)

2.5各組腎皮質TGF-β1/Smads通路蛋白表達的變化與普食組相比，高鹽組及高鹽+替米沙坦組腎皮質α-SMA、TGF-β1、Smad2/3、Smad7蛋白表達均明顯增加(均P<0.05)，替米沙坦組較高鹽組明顯降低(均P<0.05)。見表3，圖3。

表3　各組腎皮質TGF-β1/Smads通路蛋白表達的變化

圖3　各組腎皮質TGF-β1/Smads通路蛋白表達的變化

3　討　論

長期高鹽飲食是高血壓發生發展的重要環境因素之一，但高鹽飲食對靶器官損害的機制目前仍不清楚。本實驗從第8周開始高鹽組大鼠血壓逐漸升高，并持續至實驗末。說明長期高鹽飲食可導致Wistar大鼠血壓升高，與文獻結果一致〔4〕。本文觀察到，高鹽飲食的攝入對腎小球有損傷，這與已有的報道一致〔5〕。本研究發現，替米沙坦能明顯降低高鹽飲食引起的血壓增高，降低尿微量白蛋白，提示替米沙坦能降低血壓和減少蛋白排泄。因此，替米沙坦除了能降低血壓外，對腎臟的保護作用值得進一步研究。

腎臟纖維化是慢性腎臟病變重要的病理表現。腎臟纖維化是一個多因素參與的復雜過程，主要包括TGF、細胞分泌因子、氧化應激、炎癥刺激等。研究證實〔6〕,TGF-β1是促進腎臟纖維化的最關鍵因子。TGF-β1 與TGF-β1Ⅱ型受體結合后,激活TGF-β1Ⅰ型受體的絲氨酸-蘇氨酸激酶,Smad2、Smad3蛋白被磷酸化,進一步與Smad4形成活性的轉錄復合物進入核內,調節相應靶基因轉錄〔6〕。高鹽可引起自發性高血壓大鼠與Wistar-Kyoto大鼠腎臟TGF-β1基因過量表達，從而導致腎小球、腎小管廣泛纖維化。研究發現，腎小管上皮細胞、內皮細胞、足細胞及腎小球上皮細胞均可以發生表型轉化，參與腎臟纖維化的形成〔6〕。在腎間質纖維化發生發展中，腎小管上皮細胞可轉化為肌成纖維細胞,而α-SMA是肌成纖維細胞的特征蛋白，α-SMA陽性的肌成纖維細胞是主要的基質合成細胞〔7〕。進一步相關研究發現，給予Dahl鹽敏感大鼠TGF-β1抗體治療后，腎臟TGF-β1 mRNA 及蛋白的表達下調，可降低高鹽飲食引起的血壓升高及改善心臟、腎臟等靶器官功能障礙〔8〕，說明抑制TGF-β1可減輕高鹽引起的腎小球和腎小管細胞損傷。Smad7是TGF-β1信號通路的負反饋調節因子,主要通過與TGF-β1Ⅰ型受體結合抑制TGF-β1信號轉導〔9〕。研究表明，過量表達的Smad7可通過阻斷活化的Smad2、3抑制α-SMA的表達，從而發揮了逆轉上皮間充質轉化、抑制腎臟纖維化形成的作用〔10〕。研究發現，替米沙坦可通過激活過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)-γ抑制肝臟纖維化〔11〕。替米沙坦可通過抑制巨噬細胞的浸潤，降低單側輸尿管結扎小鼠HIF-1α的表達，減輕單側輸尿管結扎小鼠腎臟纖維化〔12〕。課題組前期研究發現，替米沙坦通過抑制TGF-β1/Smads通路減輕長期高鹽飲食誘導Wistar大鼠血壓升高及心肌纖維化〔13〕，同時，替米沙坦可改善長期高鹽飲食誘導Wistar大鼠腎臟功能損害和保護腎小球損害〔14〕，但其機制尚不明確。本實驗發現，TGF-β1/smads通路在高鹽誘導的腎臟纖維化進程中起著重要的作用，而Smad7代償性增高不能阻斷腎臟纖維化的發生。本研究提示替米沙坦能明顯改善腎小球纖維化，可能通過抑制TGF-β1/smads通路有關。

綜上所述，TGF-β1/smads通路參與高鹽誘導的腎臟纖維化進程，替米沙坦可能通過抑制TGF-β1/smads通路改善腎臟纖維化，從而改善高鹽誘導高血壓所致的腎損害。

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