過表達N-Myc下游調(diào)節(jié)基因3促進Hela宮頸癌細胞增殖和遷移

符　婕　白　雪　楊琳紅　陳立平　魏　宏　李　晶　齊亞靈　王偉群

(佳木斯市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江　佳木斯　154002)

N-Myc下游調(diào)節(jié)基因(NDRG)家族是原癌基因N-myc下游調(diào)控基因，共包括4個成員，分別為NDRG1、NDRG2、NDRG3 和NDRG4。近年來的研究表明，NDRG成員在腫瘤的發(fā)生與演進中發(fā)揮重要的作用，并且發(fā)現(xiàn)同一成員可同時具有腫瘤促進和抑制雙重作用，其原因可能是由各成員的組織特異性所決定的〔1〕。本實驗研究NDRG3對Hela細胞增殖、遷移的作用及機制。

1　材料與方法

1.1實驗細胞及主要材料Hela宮頸癌細胞株購自中科院上海細胞庫；RPMI1640 培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購自美國GIBCO公司；山羊抗NDRG3多克隆抗體購置加拿大SANTA CRUZ公司；細胞遷移(Transwell)小室、細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板購置美國CORNING公司；趨化因子CXC配體(L)5酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)及細胞計數(shù)試劑(CCK)-8試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2細胞轉(zhuǎn)染及鑒定將Hela細胞接種于6孔板中(6×105個/孔)，細胞所用培養(yǎng)基為2 ml含10% FBS、無雙抗的RPMI1640；將孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度達到80%后，更換上述培養(yǎng)基；依照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染；48 h后加入遺傳霉素(G418)進行篩選(終濃度為4 ng/μl)；行Western 印跡實驗檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3CCK-8實驗將親代(Parental)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(Mock)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(Overexpression)Hela細胞株分別接種于96孔板中(2×103個/孔)，細胞所用培養(yǎng)基為100 μl含10% FBS及雙抗的RPMI1640；將孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔24 h進行CCK-8實驗。CCK-8實驗具體操作：(1)向每孔中加入10 μl CCK-8試劑；(2)37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；(3)酶標儀讀取450 nm處吸光度值。

1.4Transwell實驗將上述3株細胞分別接種于Transwell小室中(1×104個/室)，所用培養(yǎng)基為100 μl無FBS的RPMI1640；將小室置于24孔板各孔，孔板中培養(yǎng)基為600 μl含10%FBS的RPMI1640；將孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h和24 h后用脫脂棉簽擦拭小室內(nèi)表面以去除沒有遷移的細胞；結(jié)晶紫染色，沖洗后進行拍照、計數(shù)。

1.5ELISA實驗將上述3株細胞分別接種于6孔板中(1.5×105個/孔)，所用培養(yǎng)基為1 ml含10% RPMI1640；將細胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基上清，按試劑盒操作步驟檢測CXCL5濃度。

1.6統(tǒng)計分析采用SPSS19.0軟件進行q檢驗。

2　結(jié)　果

2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的鑒定Parental，Mock和Overexpression三組細胞的NDRG3相對表達量分別為0.682±0.179，0.783±0.137和1.312±0.159。Overexpression與Parental、Mock比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，由此說明已經(jīng)構(gòu)建了NDRG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

2.2過表達NDRG3促進Hela細胞的增殖細胞培養(yǎng)至72 h和96 h，Overexpression組吸光度值明顯高于Parental和Mock組(P<0.05或<0.01)，由此可見，過表達NDRG3可促進Hela細胞的增殖能力。見表1。

2.3過表達NDRG3促進Hela細胞的遷移細胞培養(yǎng)至24 h和36 h，Overexpression組遷移細胞數(shù)明顯多于Parental和Mock組(P<0.05)，由此可見，過表達NDRG3可促進Hela細胞的遷移能力。見表2。

表1　過表達NDRG3促進Hela細胞的增殖吸光度,n=8)

與Parental和Mock比較：1)P<0.05，2)P<0.01;表2同

表2　過表達NDRG3促進Hela細胞的遷移細胞數(shù)，n=6)

2.4過表達NDRG3促進Hela細胞分泌CXCL5Parental和Mock組CXCL5分泌性蛋白量分別為(86.36±7.73)ng/ml和(87.12±7.39)ng/ml，兩者顯著低于Overexpression組〔(108.58±8.09)ng/ml,P<0.01〕。

3　討　論

NDRG蛋白家族4個成員(NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4)的氨基酸同源性高達57%～65%，它們最顯著特征是都具有一個NDR和一個α/β 水解酶折疊區(qū)域。在功能上，NDRG家族成員可參與細胞增殖、分化、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)等多種過程，同時亦在腫瘤中發(fā)揮重要作用〔1〕。研究表明，NDRG1在多種腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和食管鱗狀細胞癌具有轉(zhuǎn)移抑制功能〔2〕。然而，特異性沉默肝癌細胞NDRG1的表達，可抑制細胞增殖、侵襲和裸鼠移植瘤的生長，由此可見，NDRG1在肝癌中具有腫瘤促進功能〔3〕。Deng等〔4〕報道轉(zhuǎn)染NDRG2的腫瘤細胞會發(fā)生增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降的現(xiàn)象。與NDRG1一樣，NDRG4也具有腫瘤促進和抑制的雙重作用，一方面在結(jié)腸直腸癌中其可減少癌細胞的增殖和侵襲〔5〕；而另一方面其又可促進成膠質(zhì)細胞瘤的增殖與存活〔6〕。

本實驗研究表明，過表達NDRG3基因在顯著促進Hela細胞的增殖和遷移的同時，還上調(diào)Hela的分泌性趨化因子CXCL5蛋白水平，該結(jié)果與我們先前在前列腺癌中的研究結(jié)果相一致〔7〕。同樣，我們在之前的研究也顯示CXCL5與NDRG3一樣，均可促進前列腺癌細胞的增殖〔8〕，提示NDRG3/CXCL5軸在腫瘤中的重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞、間質(zhì)細胞、炎性細胞等多種細胞可分泌趨化因子經(jīng)自分泌和旁分泌途徑參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和發(fā)展進程〔9〕。基于此，本研究推斷，在宮頸癌中上調(diào)NDRG3表達可促進腫瘤細胞分泌CXCL5進入腫瘤微環(huán)境，作為微環(huán)境中的一種活性成分，CXCL5進而經(jīng)與腫瘤細胞，間質(zhì)細胞、炎性細胞上的CXCL5受體(CXCR2)作用而發(fā)揮促癌功能。

1Melotte V，Qu X，Ongenaert M，etal.The N-myc downstream regulated gene (NDRG) family：diverse functions，multiple applications〔J〕.FASEB J，2010；24(11)：4153-66.

2Yang X，An L，Li X.NDRG3 and NDRG4，two novel tumor-related genes〔J〕.Biomed Pharmacother,2013；67(7)：681-4.

3Yan X，Chua MS，Sun H，etal.N-Myc down-regulated gene 1 mediates proliferation，invasion，and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Cancer Lett，2008；262 (1)：133-42.

4Deng Y，Yao L，Chau L，etal.N-Myc downstreamregulated gene 2 (NDRG2) inhibits glioblastoma cell proliferation〔J〕.Int J Cancer，2003；106(3)：342-7.

5Melotte V，Lentjes MH，van den Bosch SM，etal.N-Myc downstream regulated gene 4 (NDRG4)：a candidate tumor suppressor gene and potential biomarker for colorectal cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst，2009；101(13)：916-27.

6Schilling SH，Hjelmeland AB，Radiloff DR，etal.NDRG4 is required for cell cycle progression and survival in glioblastoma cells〔J〕.J Biol Chem，2009；284 (37)：25160-9.

7Wang W，Li Y，Li Y，etal.NDRG3 is an androgen regulated and prostate enriched gene that promotes in vitro and in vivo prostate cancer cell growth〔J〕.Int J Cancer，2009；124(3)：521-30.

8齊亞靈，王偉群，張建華，等.CXC 趨化因子配體 5 對前列腺癌細胞生長的作用〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(11)：3035-6.

9Cheng ZH，Shi YX，Yuan M，etal.Chemokines and their receptors in lung cancer progression and metastasis〔J〕.J Zhejiang Univ Sci B，2016；17(5)：342-51.